临床样本收集与分组
建立包含正常、癌前病变和早期宫颈癌的临床队列，用于标志物验证。
收集284例患者的宫颈脱落细胞和血清样本，分为正常对照（75例）、癌前病变HSIL/CIN II/III（88例）和早期宫颈鳞癌（121例）。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
FBLN1和ANT3作为宫颈癌早期检测潜在生物标志物的发现与验证
Discovery and validation of FBLN1 and ANT3 as potential biomarkers for early detection of cervical cancer.
实验完整度
高包括临床样本（284例）ELISA验证、细胞系分泌组定量蛋白质组学、LC-PRM/MS靶向验证，以及CRISPR/Cas9基因编辑功能实验，形成多层次证据。
主要模型
宫颈癌临床队列（284例，含正常、癌前病变、早期宫颈癌） 宫颈癌细胞系（C-33A, SiHa, Caski） CRISPR/Cas9基因编辑SiHa细胞（KoE6/E7 SiHa）
重点核对
临床样本分组：正常对照75例、癌前病变88例、早期宫颈癌121例 HPV分型：37种HPV基因型检测，灵敏度与特异性均>95% 分泌组分析条件：细胞在无血清培养基中培养24小时，过滤、超滤，3次重复 CRISPR/Cas9敲除E6/E7：使用特异gRNA，转导后经嘌呤霉素和潮霉素筛选，单克隆筛选 LC-PRM/MS：使用同位素标记内标肽（DSPSAPVNVTVR），每个蛋白设计两个肽段
摘要
背景：验证与HPV感染相关的宫颈癌及癌前病变的标志物。方法：使用三种不同的宫颈癌细胞系C-33A、SiHa和Caski进行无标记定量蛋白质组学的分泌组分析。从284名患者中收集宫颈脱落细胞和匹配的血清样本，包括正常对照（n=75，26.41%）、癌前病变（n=88，30.99%）和早期宫颈鳞癌（n=121，42.61%）。通过PCR和杂交进行HPV分型和定量。通过ELISA定量先前筛选研究（组织、血浆、细胞）中鉴定的20种候选蛋白。最后，使用高定量平行反应监测质谱评估候选血清标志物的特异性和敏感性。结果：虽然发现CC与高危HPV亚型相关，但高危HPV的血清抗体与宫颈癌的进展无显著相关。对于四种蛋白CLU、APOA4、APOE和MLH3，患者组之间存在显著差异，但由于敏感性和特异性不足且变异性大，均无法用于临床应用。随后对宫颈癌细胞系进行的蛋白质组分泌组分析鉴定了一组729种常见蛋白。将该数据集与ELISA测量结果交叉引用，揭示了六种候选蛋白，其中两种FBLN1和ANT3显示出与HPV感染的共现（分别为75.7%和85%），并且在敏感性和特异性方面具有良好的诊断能力。通过使用CRISPR/Cas9基因编辑丢失E6/E7后，KoE6/E7 SiHa中ANT3和FBLN1的含量下调，这表明宫颈癌中ANT3和FBLN1的表达可能受HPV感染的影响。结论：FBLN1和ANT3可能是潜在的肿瘤和HPV相关的血清标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 寻找与HPV感染相关的宫颈癌及癌前病变的血清生物标志物，以实现早期检测。
- 核心机制
- HPV感染可能通过E6/E7致癌蛋白影响FBLN1和ANT3的表达，因为敲除E6/E7后两者的表达下调。
- 主要证据
- 基于284例临床样本的ELISA和LC-PRM/MS验证，显示FBLN1和ANT3在癌前病变和宫颈癌中水平升高，并与HPV感染共现（75.7%和85%）；细胞实验表明HPV阳性细胞系中表达较高，敲除E6/E7后表达下调。
- 研究意义
- FBLN1和ANT3有望作为HPV相关宫颈癌的早期血清标志物，为开发检测试剂盒提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HPV分型检测
确定各组的HPV感染状态和基因型分布。
使用PCR和杂交方法检测37种HPV基因型。
ELISA定量候选蛋白
在284例血清样本中验证20种候选蛋白的表达差异。
使用ELISA检测20种候选蛋白（包括CLU, APOA4, APOE, MLH3等）。
细胞系分泌组分析
鉴定宫颈癌细胞系分泌蛋白，寻找候选标志物。
对C-33A、SiHa和Caski细胞进行无标记定量蛋白质组学分析，鉴定729种常见分泌蛋白。
LC-PRM/MS验证
在62例血清样本中定量验证候选蛋白。
使用LC-PRM/MS检测FBLN1、ANT3等蛋白的肽段。
CRISPR/Cas9敲除E6/E7
验证HPV E6/E7对ANT3和FBLN1表达的影响。
在SiHa细胞中敲除E6/E7，检测ANT3和FBLN1的表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| HPV分型 | Hybribio核酸扩增和基因分型系统 | Hybribio | -- |
| Hybrimax试剂盒 | Hybribio | -- | |
| 血清HPV抗体检测 | 高危HPV L1衣壳蛋白IgG ELISA试剂盒 | Antibodies-Online | ABIN1000221 |
| ELISA | ELISA试剂盒 | LSBio | -- |
| ELISA试剂盒 | Abnova | -- | |
| ELISA试剂盒 | USCN | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 蛋白制备 | 蛋白酶抑制剂混合物 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白消化 | 二硫苏糖醇 | -- | -- |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| Microcon YM-30超滤管 | -- | -- | |
| C18-SD萃取盘柱 | 3M | -- | |
| LC-MS/MS | EASY-nLC1000液相色谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY色谱柱SC200 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Q-Exactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PRM-MS | Easy nLC 1200液相色谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q-Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 同位素标记标准肽 | -- | -- | |
| qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Hifair®II第一链cDNA合成SuperMix | Yeason | -- | |
| Hieff qPCR SYBR Green预混液 | Yeason | -- | |
| 7500实时荧光定量PCR系统 | ABI | -- | |
| Western blotting | 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- |
| ANT3抗体 | Proteintech | 14B41-1-AP | |
| FBLN1抗体 | Bioss | bs-0809R | |
| E6/E7抗体 | Abcam | ab70 | |
| E6/E7抗体 | Abcam | ab30731 | |
| GAPDH抗体 | Yeasen | -- | |
| 过氧化物酶标记二抗 | Abclonal | -- | |
| 化学发光液 | Yeasen | -- | |
| CRISPR/Cas9 | sgRNA E6/E7慢病毒 | Cyagen | -- |
| EGFP慢病毒 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | Merck | -- | |
| 潮霉素 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 共聚焦培养皿 | Nest | -- |
| Triton-X | Solabio | -- | |
| 山羊血清 | Solabio | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 统计分析 | Graphpad Prism | -- | -- |
| IBM SPSS统计软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 样本量（正常75例，癌前88例，宫颈癌121例），年龄范围29-70岁，汉维比例0.83:1，分期标准（早期宫颈癌<IIa） 阅读提示：Methods: Collection of clinical specimens |
| HPV分型 | 检测方法（PCR和杂交），37种基因型覆盖，灵敏度特异性>95% 阅读提示：Methods: HPV genotyping of cervical exfoliated cells |
| ELISA检测 | 20种候选蛋白，试剂盒品牌（LSBio/Abnova/USCN），三次重复，7点标准曲线 阅读提示：Methods: ELISA |
| 分泌组分析 | 细胞系（C-33A, SiHa, Caski），无血清处理24小时，过滤超滤条件，质谱仪器设置 阅读提示：Methods: Proteomic secretome analysis of cervical cancer cell lines |
| LC-PRM/MS验证 | 62个样本（正常20，HSIL16，宫颈癌26），同位素内标肽，每个蛋白两个肽段 阅读提示：Methods: Validation of candidate makers by liquid chromatography and parallel reaction monitoring mass spectrometry (LC-PRM/MS) |
| CRISPR/Cas9敲除 | gRNA序列，转导次数，嘌呤霉素和潮霉素筛选剂量，单克隆筛选 阅读提示：Methods: E6/E7 knockout by CRISPR/Cas9 gene editing |
| qPCR和Western blot | 引物序列（补充表S2），抗体稀释比例，内参GAPDH 阅读提示：Methods: Total RNA isolation and quantitative real‐time PCR (qPCR)、Western blotting |