体内肾IRI模型建立与Nrf1和焦亡标志物检测
观察肾缺血再灌注后肾小管上皮细胞焦亡程度及Nrf1表达变化，确定Nrf1是否参与焦亡过程
对C57BL/6小鼠进行肾缺血30分钟并再灌注6、12、24小时，通过TUNEL染色、IHC、Western blot和qRT-PCR检测Nrf1和GSDMD-N的表达。
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鉴定microRNA-92a-3p通过HO-1靶向Nrf1调控肾小管上皮细胞焦亡的关键作用
Identification of MicroRNA-92a-3p as an Essential Regulator of Tubular Epithelial Cell Pyroptosis by Targeting Nrf1 via HO-1.
实验完整度
高包含体内小鼠肾IRI模型和体外TCMK-1细胞OGD/R模型，并进行了Nrf1过表达、miR-92a-3p抑制及HO-1抑制剂干预等功能验证和机制验证。
主要模型
C57BL/6小鼠肾缺血再灌注损伤模型 TCMK-1细胞OGD/R模型 Nrf1过表达的TCMK-1细胞系 293T细胞双荧光素酶报告系统
重点核对
C57BL/6小鼠（8周龄，雄性，20-25g）肾缺血30分钟和再灌注6、12、24小时 TCMK-1细胞OGD处理24小时后再复氧2、4、8小时 antagomir miR-92a-3p或antagomir NC（10mg/kg尾静脉注射） ZnPPIX（HO-1抑制剂）浓度10μg/μl，处理24小时 Nrf1过表达慢病毒感染MOI=20
摘要
肾缺血再灌注损伤（IRI）是急性肾损伤（AKI）的主要原因，目前尚无有效治疗方法。探索肾IRI的分子机制对于预防AKI及其向慢性肾脏病和终末期肾病的演变至关重要。本研究旨在确定miR-92a-3p在肾小管上皮细胞（TEC）焦亡中的生物学功能和分子机制。我们研究了核因子-红细胞2相关因子1（Nrf1）与体内缺血再灌注和体外氧-葡萄糖剥夺/复氧（OGD/R）诱导的TEC焦亡之间的关系。微小RNA（miRNA）是基因表达的调控因子，在肾IRI的进展中发挥作用。Nrf1被确认为miRNA miR-92a-3p的潜在靶标。此外，抑制miR-92a-3p在体外减轻了氧化应激，并降低了体内外NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的表达水平。此外，锌原卟啉IX（一种血红素加氧酶-1抑制剂）减弱了Nrf1过表达对OGD/R诱导的TEC氧化应激和焦亡的保护作用。本研究结果表明，在肾IRI中抑制miR-92a-3p可通过靶向Nrf1减轻TEC氧化应激和焦亡。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- miR-92a-3p在肾缺血再灌注损伤中是否通过靶向Nrf1调节肾小管上皮细胞焦亡及其分子机制？
- 核心机制
- miR-92a-3p通过靶向Nrf1并经由HO-1信号通路调控肾小管上皮细胞的氧化应激和焦亡。
- 主要证据
- 在体内肾IRI模型和体外OGD/R诱导的TCMK-1细胞中，Nrf1表达降低而焦亡标志物升高；Nrf1过表达抑制焦亡；miR-92a-3p抑制可减轻氧化应激和焦亡，而ZnPPIX逆转Nrf1过表达的保护作用。
- 研究意义
- 本研究揭示了miR-92a-3p在肾IRI中的新机制，为AKI提供潜在的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外OGD/R细胞模型建立与Nrf1和焦亡标志物检测
验证体外OGD/R诱导的TCMK-1细胞中Nrf1表达变化及焦亡情况
TCMK-1细胞经OGD处理24小时后复氧2、4、8小时，通过CCK-8、Western blot和qRT-PCR检测细胞活力和Nrf1、GSDMD-N表达。
Nrf1过表达细胞系建立及功能验证
验证Nrf1过表达对OGD/R诱导的TCMK-1细胞焦亡的影响
使用慢病毒构建Nrf1稳定过表达的TCMK-1细胞系，经OGD/R处理后通过Western blot检测焦亡相关蛋白、CCK-8检测活力、LDH释放和ELISA检测IL-1β/IL-18。
miR-92a-3p靶向Nrf1的预测和验证
验证miR-92a-3p是否直接靶向Nrf1
通过生物信息学预测，并利用双荧光素酶报告基因实验在293T细胞中验证miR-92a-3p对Nrf1-3'UTR的直接结合。
抑制miR-92a-3p对氧化应激和焦亡的影响（体外）
验证抑制miR-92a-3p是否能减轻OGD/R诱导的TEC氧化应激和焦亡
TCMK-1细胞转染antagomir miR-92a-3p后经OGD/R处理，检测SOD、MDA、IL-1β、IL-18及Nrf1、NLRP3、GSDMD-N、caspase-1的表达。
抑制miR-92a-3p在体内对肾IRI的保护作用
验证体内抑制miR-92a-3p是否能减轻肾IRI所致的肾小管损伤和焦亡
小鼠经尾静脉注射antagomir miR-92a-3p后实施IRI，通过HE染色、TUNEL、IHC、Western blot检测肾损伤和焦亡标志物，并检测BUN和SCr水平。
HO-1在Nrf1保护作用中的介导机制验证
验证Nrf1过表达的保护作用是否通过HO-1介导
在Nrf1过表达的TCMK-1细胞中联合使用HO-1抑制剂ZnPPIX，检测ROS水平、细胞焦亡（流式细胞术）、焦亡相关蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | TCMK-1细胞 | American Type Culture Collection | CCL-139 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- | |
| 药物处理 | 锌原卟啉IX | Wako Pure Chemical Industries | -- |
| 细胞转染 | pUC57-Nrf1质粒 | -- | -- |
| 载体构建 | pLVX-mCMV-ZsGreen-IRES-Puro载体 | Wuhan Viral Therapy Technologies Co., Ltd | -- |
| 分子克隆 | EcoRI限制酶 | NEB | -- |
| SpeI限制酶 | NEB | -- | |
| T4 DNA连接酶 | TransGen BioTech | BM121 | |
| 琼脂糖凝胶回收试剂盒 | Omega | -- | |
| JM109感受态细胞 | Wuhan Viral Therapy Technologies Co., Ltd | -- | |
| 细胞转染 | 慢病毒包装试剂盒 | Wuhan Viral Therapy Technologies Co., Ltd | -- |
| TUNEL检测 | TUNEL试剂盒 | Roche | 11684817910 |
| 细胞活力检测 | CCK-8检测试剂盒 | Beyotime | C0038 |
| LDH释放检测 | LDH释放检测试剂盒 | Beyotime | C0017 |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Revert Aid第一链cDNA合成试剂盒 | Invitrogen | K1622 | |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | Abcam | ab197742 |
| IL-18 ELISA试剂盒 | Abcam | ab216165 | |
| 氧化应激检测 | ROS检测试剂盒 | Beyotime | S0033M |
| MDA检测试剂盒 | Beyotime | S0131M | |
| SOD检测试剂盒 | Beyotime | S0109 | |
| 肾功能检测 | 尿素氮B检测试剂盒 | Wako | -- |
| LabAssayTM肌酐检测试剂盒 | Wako | -- | |
| 流式分析 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | 558064 |
| 免疫组化 | 正常山羊血清 | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc. | 16210072 |
| 抗IL-1β抗体 | Abcam | ab9722 | |
| 抗IL-18抗体 | Abcam | Ab71495 | |
| 抗GSDMD-N抗体 | Bioss | bs-14287R | |
| 抗Nrf1抗体 | Abcam | ab175932 | |
| 免疫荧光 | 驴血清 | Sigma-Aldrich | D9663 |
| 二抗 | Invitrogen | A32731 | |
| DAPI | Roche | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 抗β-actin抗体 | Abcam | ab8224 | |
| 抗HO-1抗体 | Abcam | ab68477 | |
| 抗NLRP3抗体 | Abcam | ab214185 | |
| 抗caspase-1抗体 | Abcam | ab138483 | |
| HRP偶联二抗 | Abcam | ab6789 | |
| Odyssey红外成像系统 | LI-COR Biotechnology | -- | |
| 统计分析 | SPSS 22.0软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | C57BL/6小鼠（8周龄，雄性，20-25g），缺血30分钟和再灌注时间（6、12、24小时），每组n=6 阅读提示：参见Materials and Methods之Animals and Surgical Protocols |
| 细胞模型 | TCMK-1细胞（ATCC CCL-139），OGD处理24小时及复氧时间（2、4、8小时），每组n=3 阅读提示：参见Materials and Methods之Cell Culture and Transfection |
| 药物处理 | ZnPPIX浓度（10μg/μl）处理24小时 阅读提示：参见Materials and Methods之Cell Culture and Transfection |
| 基因操作 | 慢病毒感染MOI=20，构建Nrf1过表达稳定细胞系 阅读提示：参见Materials and Methods之Establishment of Nrf1-Overexpression Cell Line |
| 体内给药 | antagomir miR-92a-3p或antagomir NC（10mg/kg）尾静脉注射，缺血前或再灌注时？ 阅读提示：参见Materials and Methods之Animals and Surgical Protocols |