驴参考基因组组装与注释
获得高质量的染色体水平驴基因组，为后续进化分析提供参考。
采用Illumina短读长、PacBio长读长和Hi-C技术进行混合组装，并进行了重复序列注释和基因注释。
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驴基因组为驯化与毛色选择提供新见解
Donkey genomes provide new insights into domestication and selection for coat color.
实验完整度
高包含基因组组装与注释、群体遗传学分析、选择信号扫描、组织学检测及基因表达验证，证据层级涵盖基因组、群体和表型。
主要模型
德州驴（Dezhou donkey） 126头家驴和7头野驴（包括索马里野驴、亚洲野驴） Dun与非Dun毛色驴皮肤和毛囊组织
重点核对
TBX3基因下游1 bp缺失（chr8:g.42742556 CT>C−）的基因型与毛色表型的关联 Dun与非Dun驴皮肤中TBX3 mRNA及色素相关基因的表达差异 选择信号扫描方法（XP-EHH、FST、ROD）的阈值及最强信号区域 群体遗传分析中样本的地理分布和数量
摘要
关于驴进化历史的现有知识由于缺乏考古学和全基因组多样性数据仍不完整。为填补这一空白，我们从头组装了一个雄性德州驴的染色体水平参考基因组，并分析了126头家驴和7头野驴的基因组。群体基因组学分析表明，驴在非洲被驯化，并确凿地显示出Y染色体变异水平降低以及父系和母系历史不一致，这可能反映了繁殖管理的影响。我们还研究了毛色的遗传基础。野驴表现出稀释的灰色色素沉着（Dun表型），而家驴则表现出非稀释的黑色或栗色毛色（非Dun），这可能在驯化过程中确立。在这里，我们表明非Dun表型是由TBX3基因下游的1 bp缺失引起的，该缺失降低了该基因的表达及其对色素沉着的抑制作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 驴的驯化历史及其毛色（Dun与非Dun）的遗传基础是什么？
- 核心机制
- TBX3基因下游1 bp缺失降低了TBX3的表达，减弱其对色素沉积的抑制作用，导致非Dun毛色。
- 主要证据
- 通过对126头家驴和7头野驴的全基因组分析，结合选择信号扫描、转录组和定量RT-PCR，发现非Dun驴中TBX3表达下调，且该缺失与表型完全关联。
- 研究意义
- 该研究为驴的非洲驯化提供了基因组证据，并揭示了马和驴在Dun毛色上的趋同选择，强调了TBX3在驯化中的重要性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
群体基因组学分析
阐明驴的驯化起源和群体结构。
对83头家驴和2头亚洲野驴进行重测序，结合已发表数据共133个个体，进行系统发育树、PCA、Admixture、D统计量等分析。
选择信号扫描定位毛色相关基因
鉴定与Dun/non-Dun毛色相关的基因组区域。
比较25个Dun和23个non-Dun驴的基因组，使用XP-EHH、FST和ROD方法进行选择信号扫描。
候选因果突变的功能验证
验证TBX3基因下游1 bp缺失对基因表达和色素沉积的影响。
对3头Dun和3头non-Dun驴进行皮肤转录组测序、qRT-PCR、组织学和免疫组化分析。
种间趋同比较
比较马和驴中TBX3基因的变异模式，评估趋同进化。
比对了马的非Dun突变位点与驴的1 bp缺失位置，并预测转录因子结合位点。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因组测序 | Puregene组织核心试剂盒A | Qiagen | -- |
| HiSeq 2000测序仪 | Illumina | -- | |
| PacBio Sequel测序系统 | Pacific Biosciences | -- | |
| BluePippin系统 | Sage Science | -- | |
| Hi-C测序 | Covaris LE220超声波破碎仪 | Covaris | -- |
| 转录组测序 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 第一链合成预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Super Script II逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 第二链合成预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 末端修复混合液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| A尾添加混合液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA索引接头 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 连接混合液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PCR引物混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TaqMan探针 | -- | -- | |
| cBot仪器 | Illumina | -- | |
| HiSeq 4000 PE簇生成试剂盒 | Illumina | -- | |
| HiSeq 4000 SBS测序试剂盒 | Illumina | -- | |
| 重测序 | Trimmomatic | -- | -- |
| 基因分型 | RelaxGene血液DNA提取系统 | TIANGEN | -- |
| ABI 3730xl DNA分析仪 | Applied Biosystems | -- | |
| RT-qPCR | 转录第一链cDNA合成SuperMix试剂盒 | TransGen | -- |
| LightCycler 480 II实时荧光定量PCR检测系统 | Roche | -- | |
| SYBR Premix Ex Taq II试剂盒 | TAKARA | -- | |
| 免疫组化 | 兔抗TBX3抗体 | Bioss | bs-10266R |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因组组装 | 样本为纯种德州公驴，测序平台和数据量（Illumina短读长、PacBio长读长、Hi-C覆盖度） 阅读提示：Methods: Genome sequencing, Genome assembly |
| 群体遗传学分析 | 样本数量（126头家驴，7头野驴），地理分布，平均测序深度（10.9×） 阅读提示：Methods: Resequencing and identification of polymorphisms, Population genetics (Results) |
| 选择信号扫描 | Dun和non-Dun样本数量（23 vs 21），窗口大小（20kb），步长（10kb），阈值（XP-EHH>2.5, FST>0.3, ROD>0.8） 阅读提示：Methods: Selection scan for coat color |
| 基因表达验证 | 样本数（3 Dun, 3 non-Dun），皮肤部位（臀部），RNA提取和qPCR条件（内参β-actin） 阅读提示：Methods: Transcriptome sequencing, RT-qPCR for the TBX3 gene |
| 组织学分析 | 样本处理（4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片厚度4μm），染色方法（H&E，免疫组化/荧光），抗体稀释度（1:200） 阅读提示：Methods: Histology and immunofluorescence |