人骨关节炎软骨中miR-1和Ihh表达检测
评估骨关节炎患者软骨中miR-1及Ihh信号通路相关基因的表达变化
收集人骨关节炎软骨及相邻正常软骨，通过RT-qPCR检测miR-1、COL2A1、Acan、Ihh、Gli1/2/3、Smo、MMP-13、COL10表达，并通过免疫组化检测Ihh和MMP-13蛋白水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
MicroRNA-1通过下调Indian hedgehog表达调控Col2a1-Cre-ERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1骨关节炎小鼠模型中的骨关节炎发展
MicroRNA‑1 regulates the development of osteoarthritis in a Col2a1‑Cre‑ERT2/GFPfl/fl‑RFP‑miR‑1 mouse model of osteoarthritis through the downregulation of Indian hedgehog expression.
实验完整度
高研究包含人软骨组织样本（n=20）和转基因小鼠模型（ACLT诱导），结合RT-qPCR、免疫组化、组织学染色、FMT在体成像及X线检查，实现了从分子表达到组织学及在体功能的多层级验证。
主要模型
人骨关节炎软骨组织（胫骨平台） Col2a1-Cre-ERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1转基因小鼠ACLT骨关节炎模型
重点核对
人类软骨样本：来源于胫骨平台内侧病变区域，对照组取同患者非负重区正常软骨 转基因小鼠：2月龄，Col2a1-Cre-ERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1基因型，他莫昔康诱导miR-1过表达（100 µg/g体重/天，连续5天） ACLT手术：3月龄小鼠右膝前交叉韧带横断术，术后2个月取材 实验分组：非他莫昔芬+ACLT、非他莫昔芬+假手术、他莫昔芬+ACLT、他莫昔芬+假手术，每组n=15 检测指标：OARSI评分、RT-qPCR检测miR-1、Ihh、Gli1/2/3、Smo、MMP-13、Col10、Col2a1、Acan表达，免疫组化及FMT检测MMPs和cathepsins
摘要
本研究利用人组织及Col2a1-Cre-ERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1骨关节炎小鼠模型评估了microRNA-1对骨关节炎发展的影响。收集人软骨组织（n=20）进行逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、组织学分析和免疫组织化学实验。通过将Col2a1-Cre-ERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1转基因小鼠进行前交叉韧带横断术建立骨关节炎转基因小鼠模型。对小鼠进行X线摄影和活体荧光分子断层成像，同时收集小鼠组织进行组织学分析、RT-qPCR和番红O染色。结果发现，在人骨关节炎软骨中，miR-1水平下调，而Indian hedgehog及其下游基因水平上调。在转基因小鼠中，他莫昔芬处理诱导miR-1以及胶原蛋白II型（Col2a1）和聚集蛋白聚糖（Acan）表达，但降低Ihh、神经胶质瘤相关癌基因同源物（Gli）1、Gli2、Gli3、平滑化同源物（Smo）、基质金属蛋白酶（MMP）-13和X型胶原（Col10）表达。番红O染色显示，与tamoxifen + ACLT组相比，non-tamoxifen + ACLT组软骨表面损伤。组织学上，tamoxifen + ACLT组观察到完整的软骨表面和较少的纤维化。免疫组织化学显示，non-tamoxifen + ACLT组关节组织中Ihh、Col10和MMP-13的蛋白表达显著高于tamoxifen + ACLT组。然而，Col2a1表达在non-tamoxifen + ACLT组关节组织中低于tamoxifen + ACLT组。RT-qPCR和FMT结果进一步证实了这些发现。总之，本研究结果表明，miR-1表达通过抑制Ihh信号传导，保护免受骨关节炎诱导的软骨损伤和基因表达变化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- miR-1是否通过调控Ihh信号通路影响骨关节炎的发生发展？
- 核心机制
- miR-1通过下调Ihh及其下游信号分子（Gli2、Gli3、Smo）的表达，抑制软骨细胞肥大和基质降解，从而保护软骨。
- 主要证据
- 在人骨关节炎软骨中观察到miR-1下调、Ihh及下游分子上调；在转基因小鼠中，他莫昔芬诱导miR-1过表达后，ACLT小鼠的OARSI评分降低，Ihh、MMP-13、Col10表达下降，Col2a1、Acan表达升高，FMT显示MMPs和cathepsins水平降低。
- 研究意义
- 研究表明miR-1在保护关节软骨免受骨关节炎诱导的退变中发挥重要作用，并伴随Ihh表达下调，提示miR-1可能成为预防和治疗骨关节炎的新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转基因小鼠模型的生成与验证
验证Col2a1-Cre-ERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1转基因小鼠能否通过他莫昔芬诱导miR-1过表达
通过基因分型确认转基因小鼠，他莫昔芬注射后检测miR-1及软骨相关基因表达，并通过X线和番红O染色评估表型。
ACLT诱导骨关节炎模型建立及分组处理
建立骨关节炎小鼠模型并评估miR-1过表达对疾病进展的影响
对转基因小鼠进行ACLT手术，分为非他莫昔芬+ACLT、非他莫昔芬+假手术、他莫昔芬+ACLT、他莫昔芬+假手术四组，他莫昔芬处理诱导miR-1过表达。术后2个月进行影像学、组织学及分子检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| 反转录 | PrimeScript RT预混液 | Takara Bio, Inc. | -- |
| miRNA提取 | miRNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| miRNA反转录 | MiScript反转录试剂盒 | Qiagen | -- |
| qPCR | TB Green Premix Ex Taq II试剂盒 | Takara | -- |
| Applied Biosystems QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| X线摄影 | 小动物X射线仪（UltraFocus） | Faxitron | -- |
| 组织切片 | 旋转切片机 | Leica Microsystems GmbH | -- |
| 组织学染色 | 番红O/固绿 | Sigma-Aldrich; Merck KGaA | -- |
| 免疫组化 | 抗小鼠Col2a1抗体 | Abcam | ab34712 |
| 抗Col10抗体 | Wuhan Boster Biological Technology, Ltd. | BA2023 | |
| 抗Ihh抗体 | BIOSS | bs-6624R | |
| 抗MMP-13抗体 | Abcam | ab39012 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | ZSGB-BIO | PV-9001 | |
| Leica DM6B显微镜 | Leica Microsystems GmbH | -- | |
| 活体成像 | FMT 4000活体成像系统 | PerkinElmer, Inc. | -- |
| MMPSense 645 FAST荧光成像剂 | PerkinElmer, Inc. | -- | |
| ProSense 750 FAST | PerkinElmer, Inc. | -- | |
| 统计 | SPSS软件 | IBM Corporation | -- |
| Graph Prism软件 | Graph Prism Software, Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人软骨组织采集 | 样本来源：胫骨平台内侧病变区及非负重区正常软骨；诊断标准：美国风湿病协会骨关节炎标准 阅读提示：Materials and methods - Human cartilage tissues |
| RT-qPCR | RNA提取方法、反转录试剂盒、qPCR条件（50°C 2min, 95°C 10min, 40循环95°C 10s, 55°C 30s, 72°C 30s）、内参基因（18s和U6） 阅读提示：Materials and methods - RT-qPCR |
| 小鼠模型 | 小鼠基因型：Col2a1-Cre-ERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1；年龄：2月龄；他莫昔芬剂量：100 µg/g体重/天，连续5天；ACLT手术在3月龄进行；术后2个月取材 阅读提示：Materials and methods - Animals and care, Transgenic mice and surgical induction of osteoarthritis with ACLT |
| 组织学评估 | 固定：4%多聚甲醛48h；脱钙：10% EDTA（pH 7.2）8周；切片厚度：6µm；染色：番红O/固绿；评分：OARSI评分（0-6分），由2名不知情病理学家评估 阅读提示：Materials and methods - Histological evaluation |
| 免疫组化 | 抗体及稀释比：Col2a1 (1:100)、Col10 (1:100)、Ihh (1:50)、MMP-13 (1:100)；抗原修复：0.1%胰蛋白酶37°C 30min；封闭：20%正常血清 阅读提示：Materials and methods - Immunohistochemistry |
| FMT | 注射时间：成像前24h尾静脉注射；探针剂量：MMPSense 645 FAST 10 µl (0.4 nmol)、ProSense 750 FAST 10 µl (0.4 nmol)；成像时间：术后2个月 阅读提示：Materials and methods - Fluorescence molecular tomography (FMT) |