动物实验设计
评估母体膳食补充Pro对胎儿生长和肠道发育的影响。
将妊娠环江小型猪随机分为三组，分别饲喂含0.77% Ala、1% Pro或1% Pro + 0.0167% DFMO的日粮，从妊娠第15天至第70天，然后在第70天屠宰收集胎儿样本。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
l-脯氨酸在胎儿猪生长和肠上皮细胞增殖中的调节作用
Regulatory role of l-proline in fetal pig growth and intestinal epithelial cell proliferation.
实验完整度
高包含体内动物实验（Huanjiang mini-pig）和体外细胞实验（IPEC-J2），并进行了功能验证（细胞增殖、细胞周期）和机制验证（多胺代谢通路、Kv通道表达）。
主要模型
Huanjiang mini-pig（妊娠母猪及胎儿） IPEC-J2细胞（猪肠上皮细胞）
重点核对
母体日粮补充1% Pro（从妊娠第15天至第70天） 体外培养IPEC-J2细胞使用400 μmol/L Pro和10 mmol/L DFMO处理4天 对照组使用0.77% Ala等氮补充 测定胎儿体重、肠道DNA和蛋白含量、多胺浓度及ODC蛋白表达
摘要
l-脯氨酸（Pro）是鸟氨酸的前体，鸟氨酸通过鸟氨酸脱羧酶（ODC）转化为多胺。多胺在肠上皮细胞的增殖中起关键作用。本研究在体内和体外研究了Pro对猪肠上皮细胞多胺代谢和细胞增殖的影响。将24头环江小型猪随机分为3组，从妊娠第15天至第70天分别饲喂含0.77%丙氨酸（Ala，等氮对照）、1% Pro或1% Pro + 0.0167% α-二氟甲基鸟氨酸（DFMO）的基础日粮。在妊娠第70 ± 1.78天测定胎儿体重和每窝胎儿数，并采集小肠和大肠。体外研究使用猪肠上皮（IPEC-J2）细胞，在含0 μmol/L Pro、400 μmol/L Pro或400 μmol/L Pro + 10 mmol/L DFMO的高糖DMEM培养基中培养4天。结果表明，母体日粮添加1% Pro增加了胎儿体重、胎儿小肠的蛋白质和DNA浓度，以及胎儿小肠和大肠中钾电压门控通道、shaker相关亚家族成员1（Kv1.1）的mRNA水平（P < 0.05）。向母猪或IPEC-J2细胞补充Pro增加了胎儿肠道和IPEC-J2细胞中ODC蛋白丰度和多胺浓度（P < 0.05）。与Pro组相比，Pro和DFMO联合给药降低了胎儿肠道中ODC蛋白表达和精胺浓度，以及IPEC-J2细胞中腐胺、亚精胺和精胺的浓度（P < 0.05）。同时，Pro补充增加了S期细胞百分比和原癌基因c-fos和c-myc的mRNA水平，而DFMO耗竭细胞多胺则增加了肿瘤蛋白p53（p53）的mRNA水平（P < 0.05）。总之，日粮补充Pro通过增强多胺合成改善了胎儿猪生长和肠上皮细胞增殖。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 母体日粮补充Pro是否通过促进多胺合成来改善胎儿猪肠道生长和肠上皮细胞增殖？
- 核心机制
- Pro作为鸟氨酸前体，通过ODC催化合成多胺，增强多胺合成进而促进肠上皮细胞增殖和胎儿生长。
- 主要证据
- 体内实验显示，母体补充Pro增加了胎儿体重、小肠DNA和蛋白质浓度、ODC蛋白丰度及多胺浓度；体外实验显示Pro增加IPEC-J2细胞ODC蛋白和多胺浓度，并增加S期细胞百分比及c-fos和c-myc mRNA水平。
- 研究意义
- 研究提出Pro作为功能性氨基酸，对胎儿生长和肠道发育有益，可能为改善胎儿肠道发育提供营养干预策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
胎儿肠道DNA和蛋白质含量测定
评估Pro对胎儿肠道生长的影响。
使用DNAZOL试剂提取DNA，用BCA法测定蛋白质含量。
体外细胞培养和处理
在体外验证Pro对肠上皮细胞多胺代谢和增殖的影响。
将IPEC-J2细胞在含不同浓度Pro和DFMO的DMEM-H培养基中培养4天，并定期更换培养基。
细胞活力与细胞周期分析
评估Pro和DFMO对细胞活力和细胞周期的影响。
使用CCK-8试剂盒测定细胞活力，使用流式细胞术分析细胞周期。
多胺浓度测定
量化Pro处理对多胺合成的影响。
使用高效液相色谱（HPLC）测定肠道和细胞中的腐胺、亚精胺和精胺浓度。
基因表达分析
测定与多胺代谢和细胞增殖相关的基因表达。
通过实时定量PCR检测ODC、Kv1.1、Kv1.5、p53、c-fos和c-myc的mRNA水平。
Western blot分析
测定ODC蛋白表达水平。
通过Western blot分析胎儿肠道和IPEC-J2细胞中的ODC蛋白丰度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 丙氨酸 | Ajinomoto Inc. | -- |
| L-脯氨酸 | Ajinomoto Inc. | -- | |
| α-二氟甲基鸟氨酸（DFMO） | Wuhan Dahua Pharmaceutical Co., Ltd | -- | |
| DNA/蛋白质测定 | DNAZOL试剂 | -- | -- |
| DNA测定 | 小牛胸腺DNA | Sigma–Aldrich | -- |
| 蛋白质测定 | 牛血清白蛋白（BSA） | Beyotime Institute of Biotechnology | -- |
| 细胞培养 | 胎牛血清（FBS） | Thermo Scientific | -- |
| 高糖DMEM培养基 | Thermo Scientific | -- | |
| 青霉素 | Thermo Scientific | -- | |
| 链霉素 | Thermo Scientific | -- | |
| 塑料培养板 | Corning Inc. | -- | |
| 细胞活力测定 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | -- |
| 细胞周期分析 | 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | -- |
| 碘化丙啶（PI） | Key GEN | -- | |
| 多胺测定 | 高氯酸（HClO4） | -- | -- |
| 丹磺酰氯 | -- | -- | |
| 多胺标准品（腐胺、亚精胺、精胺） | Sigma Chemical Co. | -- | |
| 高效液相色谱系统 | Agilent | -- | |
| 细胞周期分析 | 流式细胞仪 | BD FACSCalibur | -- |
| Western blot | 鸟氨酸脱羧酶（ODC）抗体 | Bioss Inc. | -- |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Boster Biological Technology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物实验 | 母猪日粮补充：1% Pro或0.77% Ala（等氮对照），从妊娠第15天至第70天 阅读提示：请参阅Materials and methods部分“Animals and experimental design”小节的详细信息。 |
| 动物实验 | 每处理组母猪数量、妊娠天数、胎儿数量 阅读提示：请参阅Materials and methods部分“Animals and experimental design”和Results部分“Fetal number and weight”小节。 |
| 细胞培养 | IPEC-J2细胞培养条件：DMEM-H、10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素，处理浓度和时间 阅读提示：请参阅Materials and methods部分“Cell culture and treatment”小节。 |
| 细胞活力与周期 | 细胞活力测定使用CCK-8试剂盒，细胞周期分析使用PI染色和流式细胞术 阅读提示：请参阅Materials and methods部分“Cell viability and cycle assay”小节。 |
| 多胺测定 | 样品处理：0.4 mol/L HClO4酸化，衍生化条件（NaOH、饱和Na2CO3、丹磺酰氯、40°C水浴30分钟） 阅读提示：请参阅Materials and methods部分“Determination of polyamines in the intestine and IPEC-J2 cells”小节。 |
| 基因表达分析 | RT-qPCR引物序列（见表2），内参基因β-actin，比较Ct法 阅读提示：请参阅Materials and methods部分“Real-time quantitative PCR”小节及表2。 |
| Western blot | 抗体稀释比例：ODC 1:500，β-actin 1:1000，二抗1:5000；蛋白定量归一化 阅读提示：请参阅Materials and methods部分“Western blot analysis”小节。 |