生成并鉴定星形胶质细胞特异性GDNF敲除小鼠
建立GLAST-GDNF−/− cKO小鼠，验证GDNF在星形胶质细胞中的特异性敲除及其基本表型。
将GDNFf/f小鼠与GLAST-CreERT2小鼠杂交，通过他莫昔芬诱导GDNF缺失。通过PCR确认基因型，并通过Western blot和免疫染色评估敲除效率。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
GLAST-CreERT2介导的GDNF缺失增加局灶性缺血性卒中小鼠模型中的脑损伤并加剧长期卒中结局
GLAST-CreERT2 mediated deletion of GDNF increases brain damage and exacerbates long-term stroke outcomes after focal ischemic stroke in mouse model.
实验完整度
高包含基因敲除小鼠模型、PT诱导缺血模型、组织学（Nissl、FJB）、免疫荧光、WB、行为学及氧化应激（DHE）等多项独立证据，并具有机制验证。
主要模型
GLAST-GDNF−/− cKO小鼠 光血栓（PT）诱导的局灶性缺血性卒中小鼠模型
重点核对
他莫昔芬（TAM）给药剂量和方式：100 mg/kg，口服灌胃，连续5天 PT诱导参数：Rose Bengal 30 mg/kg尾静脉注射，光照区域直径1.5 mm，定位（前囟后0.8 mm，中线外侧2.0 mm），光照2分钟 Brdu注射方案：50 mg/kg，腹腔注射，连续6天 DHE注射方案：25 mg/kg，腹腔注射，PT后6小时两次（间隔30分钟），18小时后取材
摘要
局灶性缺血性卒中（FIS）是人类死亡的主要原因。由缺血周围区域（PIR）反应性星形胶质增生引起的胶质瘢痕形成是FIS的标志。胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）最初从大鼠胶质瘤细胞系上清液中分离得到，是一种强效的促存活神经营养因子。在这里，利用CreERT2–LoxP重组技术，我们生成了诱导型且星形胶质细胞特异性的GDNF条件性敲除（cKO）小鼠，即GLAST-GDNF−/− cKO小鼠，以研究反应性星形胶质细胞（RAs）来源的GDNF对光血栓（PT）诱导的FIS后神经元死亡、脑损伤、氧化应激和运动功能恢复的影响。在非缺血条件下，我们发现成年GLAST-GDNF−/− cKO小鼠海马齿状回（DG）中Brdu+、Ki67+细胞和DCX+细胞的数量显著低于GDNF floxed（GDNFf/f）对照（Ctrl）小鼠，表明内源性星形胶质细胞GDNF可以促进成年神经发生。在缺血条件下，与Ctrl小鼠相比，GLAST-GDNF−/− cKO小鼠在PT后梗死体积、海马损伤和FJB+退行性神经元显著增加。GLAST-GDNF−/− cKO小鼠在PIR中Brdu+和Ki67+细胞密度也较低，并表现出比Ctrl小鼠更大的行为缺陷。机制上，星形胶质细胞中GDNF缺乏通过下调RAs中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）增加氧化应激。总之，我们的研究表明RAs来源的内源性GDNF通过神经再生在减少脑损伤和促进FIS后脑恢复中发挥重要作用，并提示促进RAs中的抗氧化机制是卒中治疗的一个潜在策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 反应性星形胶质细胞来源的内源性GDNF在局灶性缺血性卒中后脑损伤和功能恢复中的作用及机制是什么？
- 核心机制
- 星形胶质细胞来源的GDNF通过上调G6PD表达，增强磷酸戊糖途径的抗氧化能力，减少氧化应激，从而保护神经元。
- 主要证据
- GLAST-GDNF−/− cKO小鼠在PT后表现出梗死体积增大、海马损伤加重、FJB+神经元增多、PIR中增殖细胞和反应性星形胶质细胞减少、G6PD下调、ROS水平升高及运动行为缺陷加重。
- 研究意义
- 研究表明星形胶质细胞来源的GDNF在卒中后神经保护和恢复中起关键作用，为卒中治疗提供了潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估非缺血条件下GDNF缺失对成年神经发生的影响
探究星形胶质细胞来源的GDNF是否影响正常大脑中的神经发生。
通过Brdu标记和Ki67、DCX免疫染色检测DG中增殖细胞和神经母细胞。
建立光血栓（PT）诱导的局灶性缺血模型
诱导局灶性缺血性卒中，模拟临床缺血损伤。
小鼠麻醉后尾静脉注射Rose Bengal，用绿色光照射运动皮层区域诱导光血栓。
评估脑损伤和神经元死亡
测定GDNF缺失对缺血后脑梗死体积、海马损伤和神经元变性的影响。
通过Nissl染色测量梗死体积和海马损伤，通过FJB染色检测退行性神经元。
评估反应性星形胶质增生
检测GDNF缺失对缺血后反应性星形胶质细胞增殖和GFAP表达的影响。
通过Brdu和GFAP双标免疫染色评估PIR中增殖细胞和反应性星形胶质细胞密度及GFAP信号强度。
检测氧化应激水平
探究GDNF缺失是否影响缺血后的氧化应激。
通过G6PD和GFAP免疫染色检测G6PD表达，通过DHE染色检测活性氧（ROS）水平。
评估运动功能和行为缺陷
测定GDNF缺失对缺血后长期运动功能恢复的影响。
进行悬挂线、圆筒、旋转杆、握力测试和旷场测试，评估运动协调、力量、焦虑样行为等。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型建立 | 他莫昔芬 | Sigma | T5648 |
| 缺血模型建立 | 玫瑰红 | Sigma | 330000 |
| 神经发生检测 | 溴脱氧尿苷 | Sigma | B9285 |
| 氧化应激检测 | 二氢乙啶 | Sigma | 37291 |
| 组织学 | Fluoro-Jade B | -- | -- |
| Western blot | 磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma | P8340 |
| BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因敲除小鼠生成 | 他莫昔芬给药剂量和方式 阅读提示：材料与方法 - 生成GDNF cKO小鼠 |
| 缺血模型诱导 | Rose Bengal剂量、光照参数、麻醉剂量 阅读提示：材料与方法 - 光血栓（PT）诱导的缺血模型 |
| 神经发生评估 | Brdu注射剂量、次数、取样时间 阅读提示：材料与方法 - 5-溴-2-脱氧尿苷（Brdu）注射 |
| 氧化应激评估 | DHE注射剂量、时间点 阅读提示：材料与方法 - 二氢乙啶（DHE）体内标记活性氧 |
| 行为学测试 | 测试时间点、预训练方案 阅读提示：材料与方法 - 行为学测试 |