测量转录爆发动力学参数
通过scRNA-seq在单细胞水平估计内在噪声、爆发大小和频率
对447个G1期杂交mESCs进行RamDA-seq，通过等位基因特异性表达分析估计内在噪声并计算爆发参数。
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小鼠胚胎干细胞中转录爆发的全基因组动力学特性
Genome-wide kinetic properties of transcriptional bursting in mouse embryonic stem cells.
实验完整度
高包含scRNA-seq、smFISH、流式细胞术、CRISPR文库筛选、抑制剂处理、Suz12敲除及嵌合小鼠实验等多层级验证，涉及体外细胞模型和体内嵌合体实验，并有机制验证。
主要模型
杂交小鼠胚胎干细胞（129/CAST F1-21.6） C57BL/6J小鼠胚胎干细胞及GFP/iRFP敲入报告细胞系 嵌合小鼠（通过胚胎注射产生）
重点核对
scRNA-seq使用447个G1期杂交mESCs，基于转录本水平估计内在噪声及爆发参数 通过smFISH和流式细胞术在25个基因的KI细胞系中验证scRNA-seq结果的相关性 使用DRB、flavopiridol、KL-2、MK-2206、PD0325901等抑制剂处理细胞，观察爆发动力学变化 Suz12敲除细胞系中检测H3K27me3水平及爆发参数变化 CRISPR文库筛选在Nanog、Trim28、Dnmt3l KI细胞系中进行，重复四次分选富集低内在噪声细胞
摘要
转录爆发是启动子的随机激活和失活，导致基因表达中的细胞间异质性。然而，在哺乳动物细胞中，调控转录爆发动力学（爆发大小和频率）的机制仍然难以捉摸。在本研究中，我们进行了单细胞RNA测序以分析内在噪声和mRNA水平，从而阐明小鼠胚胎干细胞中的转录爆发动力学。信息学分析和功能实验表明，转录爆发动力学受启动子和基因体结合蛋白的组合调控，包括多梳抑制复合物2和转录延伸因子。此外，大规模基于CRISPR-Cas9的筛选确定Akt/MAPK信号通路通过调节转录延伸效率来调控爆发动力学。这些结果揭示了哺乳动物细胞中转录爆发和细胞间基因表达噪声的关键分子机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哺乳动物细胞中转录爆发动力学（爆发大小和频率）的调节机制是什么？
- 核心机制
- 转录爆发动力学由启动子和基因体结合蛋白的组合调控，包括PRC2和转录延伸因子；Akt/MAPK信号通路通过调节转录延伸效率（如Pol II暂停释放）来影响爆发动力学。
- 主要证据
- scRNA-seq显示高内在噪声基因与PRC2启动子结合正相关、与基因体转录延伸因子负相关；CRISPR筛选和抑制剂处理表明Akt/MAPK通路抑制可降低内在噪声，且SEC抑制剂处理影响爆发频率。
- 研究意义
- 为理解转录爆发的分子基础及细胞异质性提供重要信息，并可能为未来研究内在噪声在细胞命运决定中的作用奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证scRNA-seq测量的可靠性
确认scRNA-seq测量的内在噪声反映真实基因表达噪声
建立25个基因的GFP/iRFP KI细胞系，通过smFISH和流式细胞术验证scRNA-seq的测量结果。
识别影响转录爆发的分子决定因素
寻找与爆发参数相关的转录调控因子
计算爆发参数与ChIP-seq信号在启动子、基因体和增强子区域的相关性，并测试TATA框的影响。
验证PRC2和转录延伸因子的功能
测试候选因子对爆发动力学的影响
通过Suz12敲除和P-TEFb抑制剂处理，评估其对爆发参数的影响。
CRISPR文库筛选调控内在噪声的基因
无偏筛选影响内在噪声的基因
在Nanog、Trim28、Dnmt3l KI细胞系中转染CRISPR文库，通过重复分选富集低噪声细胞，并进行KEGG通路分析。
验证Akt/MAPK通路的作用
验证Akt/MAPK通路对内在噪声的调控
使用MK-2206和PD0325901处理KI细胞系，检测内在噪声、爆发大小和频率变化。
评估转录延伸因子在PD-MK条件下的作用
探索PD-MK条件下转录延伸因子对爆发调控的机制
对PD-MK条件下培养的细胞进行RNA-seq，分析转录延伸相关基因表达变化，并用flavopiridol和KL-2处理验证SEC的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
测量基因表达噪声和爆发动力学
分析转录调控因子
转录组和通路分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 层粘连蛋白511 | -- | -- |
| StemSure DMEM培养基 | Wako Pure Chemicals | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 白血病抑制因子 | Wako Pure Chemicals | -- | |
| PD0325901 | ChemScene | CS-0062 | |
| CHIR99021 | Wako Pure Chemicals | 034-23103 | |
| DRB | Sigma-Aldrich | D1916 | |
| 夫拉平度 | ChemScene | CS-0018 | |
| KL-2 | -- | -- | |
| 胆绿素 | -- | -- | |
| 基因编辑 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Life Technologies | L3000015 |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| lentiCRISPRv2载体 | Addgene | 52961 | |
| pKLV-PGKpuro2ABFP载体 | Addgene | 122372 | |
| pCAG-mTagBFP2载体 | Addgene | 122373 | |
| In-Fusion HD克隆试剂盒 | Clontech Laboratories | 639648 | |
| PCR DIG探针合成试剂盒 | Roche Diagnostics | -- | |
| 单细胞RNA测序 | RNasin Plus核糖核酸酶抑制剂 | Promega | -- |
| RealTime ready细胞裂解缓冲液 | Roche | 06366821001 | |
| NP-40裂解液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DNase I（扩增级） | -- | -- | |
| ERCC RNA加标混合液I | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| oligo(dT)18引物 | Thermo Fisher Scientific | SO131 | |
| T4基因32蛋白 | New England Biolabs | -- | |
| PrimeScript酶混合液 | TAKARA Bio Inc. | RR037A | |
| Klenow片段 | New England Biolabs | -- | |
| Nextera XT DNA文库制备试剂盒 | Illumina | FC-131-1096 | |
| AMPure XP SPRI磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| MultiNA DNA-12000试剂盒 | Shimadzu | -- | |
| Bioanalyzer Agilent高灵敏度DNA试剂盒 | Agilent | 5067-4626 | |
| KAPA文库定量试剂盒 | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Hoechst 33342染料 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| MoFlo Astrios流式细胞分选仪 | Beckman Coulter | -- | |
| HiSeq2000测序仪 | Illumina | -- | |
| 单分子荧光原位杂交 | CAL Fluor Red 590荧光染料 | Biosearch Inc. | -- |
| Quasar 670荧光染料 | Biosearch Inc. | -- | |
| 过氧化氢酶 | Sigma-Aldrich | C3155 | |
| 葡萄糖氧化酶 | -- | -- | |
| Nikon Ti-2显微镜 | Nikon | -- | |
| CSU-W1共聚焦单元 | -- | -- | |
| iXon Ultra EMCCD相机 | Andor | -- | |
| FISH-quant软件 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | BD FACSAria III流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| FluoroBrite DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫荧光 | Lab-Tek II腔室盖玻片 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Alexa Fluor 594偶联二抗 | Life Technologies | -- | |
| Alexa Fluor 488羊抗小鼠IgG | Life Technologies | -- | |
| Alexa Fluor 594羊抗兔IgG | Life Technologies | -- | |
| Alexa Fluor 647羊抗大鼠IgG | Life Technologies | -- | |
| Western blot | Immobilon转印膜 | Millipore | -- |
| QIAshredder匀浆柱 | Qiagen | -- | |
| CRISPR文库筛选 | 小鼠CRISPR敲除文库（GeCKO v2） | Addgene | 1000000052 |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| KOD FX Neo聚合酶 | TOYOBO | -- | |
| PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 凝胶提取试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 细胞周期分析 | Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647流式细胞术检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10634 |
| Vybrant DyeCycle Violet染料 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 凋亡分析 | Annexin V凋亡检测试剂盒APC | Thermo Fisher Scientific | 88-8007-72 |
| RNA测序 | RNeasy Plus Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA降解率测定 | 4-硫代尿苷 | -- | -- |
| T7高产RNA合成试剂盒 | New England Biolabs | E2040 | |
| 生物素-HPDP | Dojindo | 341-09101 | |
| Dynabeads MyOne链霉亲和素C1磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNeasy MinElute试剂盒 | Qiagen | -- | |
| ReverTra Ace qPCR RT试剂盒 | TOYOBO | FSQ-101 | |
| THUNDERBIRD SYBR qPCR混合液 | TOYOBO | QPS-201 | |
| 嵌合体生成 | C57BL/6NCr胚胎干细胞 | Japan SLC | -- |
| 数据分析 | TopHat软件 | -- | -- |
| Cufflinks软件 | -- | -- | |
| CummeRbund软件包 | -- | -- | |
| HISAT2软件 | -- | -- | |
| EMASE软件 | -- | -- | |
| Seqnature软件 | -- | -- | |
| Bowtie软件 | -- | -- | |
| edgeR软件包 | -- | -- | |
| preprocessCore软件包 | -- | -- | |
| SCALE软件 | -- | -- | |
| scran软件包 | -- | -- | |
| FindM软件 | -- | -- | |
| Galaxy平台 | -- | -- | |
| ngs.plot软件 | -- | -- | |
| Cutadapt软件 | -- | -- | |
| groHMM软件包 | -- | -- | |
| ropls软件包 | -- | -- | |
| MAGeCK软件 | -- | -- | |
| clusterProfiler软件包 | -- | -- | |
| HISAT软件 | -- | -- | |
| HTSeq软件 | -- | -- | |
| DESeq2软件包 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| scRNA-seq测量 | G1期杂交mESCs数量、生长基质（LN511）、测序方法（RamDA-seq）、数据过滤条件（平均读数<20排除） 阅读提示：Materials and Methods: 'Sequencing library preparation for RamDA-seq' and 'Estimation of the kinetic properties of transcriptional bursting using transcript-level count data' |
| KI细胞系建立 | 靶基因选择标准、敲入载体设计（GFP/iRFP、2A肽、降解序列）、转染方法（Lipofectamine 3000）、筛选（puromycin）和克隆验证（PCR、Southern blot） 阅读提示：Materials and Methods: 'Establishment of KI mESC lines' |
| smFISH验证 | 探针浓度（0.25 μM）、杂交时间（4小时）、成像系统（Nikon Ti-2, CSU-W1, iXon Ultra） 阅读提示：Materials and Methods: 'Single-molecule fluorescence in situ hybridization' |
| 流式细胞术 | BV处理（25 μM）、细胞浓度（1×10^6至5×10^6细胞/ml）、门控策略（FSC/SSC）、异常值排除（20倍IQR） 阅读提示：Materials and Methods: 'Flow cytometry analysis for calculation of intrinsic noise' |
| Suz12敲除 | sgRNA序列、转染条件（Lipofectamine 3000）、BFP阳性细胞分选、克隆筛选、H3K27me3水平验证 阅读提示：Materials and Methods: 'Suz12 K/O' |
| CRISPR文库筛选 | 文库（GeCKO v2）、MOI=0.3、分选策略（GFP/iRFP比值接近1）、重复次数（4次）、测序深度（>8百万reads） 阅读提示：Materials and Methods: 'Infection of CRISPR lentivirus library' |
| 抑制剂处理 | DRB浓度（40 μM）、flavopiridol浓度（0.25 μM in 2i, 0.125 μM in PD-MK）、处理时间（2天）、MK-2206浓度（4 μM）、PD0325901浓度（1 μM） 阅读提示：Materials and Methods: 'Cell culture and cell lines' |
| RNA-seq | RNA提取试剂盒（RNeasy Plus Mini）、方法（CEL-Seq2）、生物学重复数（3）、差异表达分析（DESeq2） 阅读提示：Materials and Methods: 'Bulk RNA-seq' |