构建神经病理性疼痛模型
模拟临床椎间孔狭窄和相关腰腿痛
在SD大鼠上实施CCD手术，插入L形不锈钢棒压缩L4/L5 DRG；此外还进行SNL手术作为另一种神经损伤模型。
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初级感觉神经元中的AXL信号参与大鼠背根神经节慢性压迫诱导的神经病理性疼痛
AXL signaling in primary sensory neurons contributes to chronic compression of dorsal root ganglion-induced neuropathic pain in rats.
实验完整度
高包含体外细胞培养、两种神经病理性疼痛模型（SNL和CCD）、行为学测试、免疫荧光、Western blot以及siRNA敲低和药理学抑制等功能验证。
主要模型
Sprague Dawley (SD) 大鼠 背根神经节慢性压迫（CCD）模型 脊神经结扎（SNL）模型 DRG原代细胞培养
重点核对
TP0903的给药剂量（0.05、0.50、1.00 μg） AXL siRNA的给药浓度（5 μM/10 μL） CCD手术模型（L4/L5 DRG压缩） 行为学测试时间点（术后第4、6、8天）
摘要
腰痛是一种在老年人中常见、高发且难以治疗的慢性疾病。临床研究表明，AXL属于酪氨酸激酶受体亚家族，介导病理性疼痛。然而，AXL如何调节疼痛行为尚不清楚。在本研究中，我们使用背根神经节慢性压迫诱导的神经病理性疼痛模型来模拟临床椎间孔狭窄及相关腰腿痛，以探讨初级感觉神经元中的AXL是否参与大鼠这种神经病理性疼痛。通过双重标记免疫荧光，我们观察到磷酸化AXL和AXL主要定位于同工凝集素B4阳性和降钙素基因相关肽阳性的神经元上，而AXL也定位于神经丝蛋白200阳性的神经元中。背根神经节慢性压迫诱导的疼痛与受损背根神经节中AXL mRNA和蛋白的上调相关。反复鞘内给予AXL抑制剂TP0903或AXL小干扰RNA可有效缓解背根神经节慢性压迫诱导的疼痛超敏反应。此外，反复鞘内给予TP0903或AXL小干扰RNA可降低受损背根神经节中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的表达，提示哺乳动物雷帕霉素靶蛋白可能介导AXL的作用。这些结果表明，背根神经节AXL的上调可能是神经病理性疼痛的外周机制的一部分，通过细胞内哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路发挥作用。因此，虽然AXL抑制剂迄今主要在肿瘤治疗中显示出临床疗效，但AXL干预也可以作为神经病理性疼痛治疗的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 初级感觉神经元中的AXL是否参与背根神经节慢性压迫诱导的神经病理性疼痛，以及其可能的机制。
- 核心机制
- DRG中AXL的表达上调可能通过激活细胞内mTOR信号通路参与疼痛的外周机制。
- 主要证据
- AXL mRNA和蛋白在受损DRG中上调；TP0903或AXL siRNA反转疼痛超敏反应；AXL干预降低DRG中mTOR表达。
- 研究意义
- AXL干预可能成为神经病理性疼痛治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测AXL在DRG中的表达与分布
观察AXL是否在损伤DRG中表达上调及其神经元类型定位
使用RT-qPCR检测AXL mRNA水平，Western blot检测p-AXL和AXL蛋白水平，免疫荧光双标检测p-AXL/AXL与IB4、CGRP、NF200、GS的共定位。
药理学抑制AXL活性
验证AXL是否介导CCD诱导的疼痛超敏反应
鞘内注射AXL抑制剂TP0903（剂量0.05, 0.50, 1.00 μg），在术前1小时和术后连续5天给药，并进行行为学测试。
基因敲低AXL表达
进一步确认AXL在疼痛中的作用
体外培养DRG神经元验证siRNA敲低效率，然后鞘内注射AXL siRNA（5 μM/10 μL）连续5天，评估其对CCD大鼠疼痛行为的影响。
检测mTOR信号通路
探讨AXL是否通过mTOR信号介导疼痛
Western blot检测CCD大鼠DRG中p-mTOR和mTOR蛋白水平，并观察TP0903或AXL siRNA处理后mTOR表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Neurobasal™-A培养基 | Gibco/ThermoFisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | JR Scientific | -- | |
| B-27™添加剂 | Gibco/ThermoFisher Scientific | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 多聚-D-赖氨酸 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 不含EDTA的胰蛋白酶溶液 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| siRNA转染 | Lipo6000转染试剂 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 药物处理 | TP0903 | MedChem Express | HY12963 |
| RNA提取 | RNAeasy™ RNA提取试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| cDNA合成 | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| qPCR | BeyoFast™ SYBR Green qPCR预混液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| AXL引物 | -- | -- | |
| GAPDH引物 | -- | -- | |
| BIO-RAD CFX96实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| Bradford蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 抗磷酸化AXL抗体 | GeneTex | -- | |
| 抗AXL抗体 | Bioss | -- | |
| 抗mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的二抗 | EMD Millipore | -- | |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | EMD Millipore | -- | |
| Champchemi成像系统 | Sagecreation Service for Life Science | -- | |
| 免疫荧光 | Leica CM3050 S冰冻切片机 | Leica | -- |
| 兔抗p-AXL抗体 | Genetex | -- | |
| Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔抗体 | Abcam | -- | |
| 抗AXL抗体 | Absin | -- | |
| 小鼠抗CGRP抗体 | Abcam | -- | |
| 小鼠抗NF200抗体 | Sigma | -- | |
| 小鼠抗GS抗体 | EMD Millipore | -- | |
| Cy3偶联的山羊抗小鼠抗体 | Abcam | -- | |
| 生物素化同工凝集素B4 | Sigma | -- | |
| Cy3偶联的亲和素 | Abcam | -- | |
| SouthernBiotech Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | -- | |
| 含DAPI的抗淬灭封片剂 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| Olympus BX53荧光显微镜 | Olympus | -- | |
| Nikon C2共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| 行为学测试 | von Frey纤维丝 | -- | -- |
| Model 37370镇痛计 | UGO | -- | |
| ZH-6C冷板 | Zheng-Hua Biologic | -- | |
| 试剂稳定保存 | RNAlater稳定液 | Thermo Scientific | -- |
| 组织保存 | AllProtect™核酸和蛋白稳定试剂 | Beyotime Biotechnology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | CCD手术具体操作、大鼠品系（SD）、年龄与体重（3-4周用于细胞培养；200-250g用于行为学） 阅读提示：Materials and Methods：Neuropathic pain models |
| 药物处理 | TP0903剂量（0.05, 0.50, 1.00 μg）、给药途径（鞘内）、给药时间（术前1小时和术后连续5天） 阅读提示：Materials and Methods：Intrathecal catheter implantation and drug administration |
| siRNA敲低 | AXL siRNA序列、浓度（体内5 μM/10 μL）、给药时间（术后第3天开始连续5天） 阅读提示：Materials and Methods：DRG cell culture and siRNA transfection、Intrathecal catheter implantation |
| 行为学测试 | 机械刺激（von Frey filaments）、热刺激（PWL）、冷刺激（cold plate）的实验参数和测试时间点（术后第4、6、8天） 阅读提示：Materials and Methods：Behavioral testing；Results：Figures 4和6图注 |
| 分子检测 | AXL和mTOR的抗体信息、蛋白提取方法、RT-qPCR引物序列及反应条件 阅读提示：Materials and Methods：RNA extraction、Western blotting、Immunofluorescence |