浓缩生长因子对牙龈间充质干细胞增殖和分化的调节:在牙科再生与修复组织工程中的潜在意义

Modulation of proliferation and differentiation of gingiva‑derived mesenchymal stem cells by concentrated growth factors: Potential implications in tissue engineering for dental regeneration and repair.

作者信息Xiao Chen, Yuhe Chen, Yali Hou, Peng Song, Minyue Zhou, Minhai Nie, Xuqian Liu
PMID31017269
发布时间2019-07
DOI10.3892/ijmm.2019.4172

实验完整度

包含细胞分离鉴定、增殖检测、成骨诱导及分子表达验证(RT-qPCR、Western blot),但无动物模型或体内验证,证据层级较为单一。

主要模型

牙龈间充质干细胞(GMSCs)原代细胞 成骨诱导分化模型(矿化诱导培养基+10% CGF)

重点核对

细胞来源:患者牙冠延长术中的正常牙龈组织 细胞代数:第3代用于后续实验 CGF浓度:10%是对GMSCs增殖的最佳浓度 分组:对照组(DMEM)、纯矿化组(成骨诱导培养基)、实验组(成骨诱导培养基+10% CGF) 检测时间点:在第7、14、21天检测ALP活性和矿化结节

摘要

本研究旨在评估与不同浓度浓缩生长因子(CGF)共培养的牙龈间充质干细胞(GMSCs)的增殖和成骨分化能力。从牙龈结缔组织中分离GMSCs,并通过流式细胞术、免疫荧光染色和免疫组织化学染色进行鉴定。通过MTT法测定细胞增殖活性,并使用细胞计数试剂盒(CCK)-8法检测CGF对MCSCs(注:原文此处应为GMSCs)的影响。通过碱性磷酸酶(ALP)阳性细胞染色和矿化结节形成实验评估矿化诱导。通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分析和western blotting评估牙本质基质酸性磷蛋白(DMP)1、牙本质涎磷蛋白(DSPP)、骨形态发生蛋白(BMP)2和runt相关转录因子(RUNX)2的mRNA和蛋白表达。流式细胞术、免疫荧光染色和免疫组织化学染色结果表明培养的细胞是GMSCs。MTT法结果显示第三代牙龈干细胞表现出最高的增殖能力,CCK-8结果表明10% CGF对GMSC增殖的促进作用最显著。ALP活性分析和矿化结节实验表明CGF可能成功诱导GMSCs的成骨分化,而RT-qPCR和western blot分析表明CGF通过调节DMP1、DSPP、BMP2和RUNX2的表达参与GMSCs的分化(P<0.05)。总之,CGF被证明能促进GMSCs的增殖和成骨分化。因此,CGF可应用于牙齿再生与修复的组织工程。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
不同浓度浓缩生长因子(CGF)对牙龈间充质干细胞(GMSCs)增殖和成骨分化能力的影响及其潜在机制。
核心机制
CGF通过上调DMP1、DSPP、BMP2和RUNX2的表达来促进GMSCs的成骨分化。
主要证据
CCK-8显示10% CGF显著促进增殖;ALP活性、矿化结节染色显示CGF促进成骨分化;RT-qPCR和Western blot显示DMP1、DSPP、BMP2和RUNX2的mRNA和蛋白表达显著增加。
研究意义
CGF可应用于牙科再生与修复的组织工程。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

GMSCs的分离与培养

从牙龈组织中获得并扩增间充质干细胞。

采集正常牙龈组织,分离上皮层和结缔组织,剪碎后接种于含15%胎牛血清的DMEM培养基中培养,并传代。

2

GMSCs的鉴定

确认所培养的细胞具有间充质干细胞特征。

通过流式细胞术检测表面标记物CD73、CD90、CD105、CD45;免疫荧光和免疫组织化学染色检测vimentin、CD90、S100A4、CD73、细胞角蛋白。

3

GMSCs增殖活性检测

评估不同代数和对不同浓度CGF的GMSCs增殖能力。

MTT法绘制不同代数GMSCs生长曲线;CCK-8法检测不同浓度CGF(5%、10%、20%、40%)处理GMSCs的活性。

4

成骨分化诱导

验证CGF能否促进GMSCs的成骨分化。

将第3代GMSCs分为三组,分别用DMEM、成骨诱导培养基和成骨诱导培养基+10% CGF培养,通过ALP活性测定和茜素红S染色评估矿化。

5

成骨相关分子表达检测

探究CGF促进成骨分化的分子机制。

在第21天提取各组细胞RNA和蛋白质,通过RT-qPCR检测DSPP、DMP1、BMP2、RUNX2的mRNA表达,通过Western blotting检测蛋白表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基HyClone; GE Healthcare Life Sciences--
胎牛血清Hangzhou Sijiqing Biological Engineering Materials Co., Ltd.--
0.25%胰酶/EDTA溶液----
CD90抗体Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd.H30901-09G
CD105抗体Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd.H31051-09H
CD73抗体eBioscience85-11-0739-41
CD45抗体Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd.H20451-09G
流式细胞仪Beckman Coulter--
CD90抗体AbcamEPR313
S100A4抗体AbcamEPR2761(2)
波形蛋白抗体AbcamEPR3776
细胞角蛋白抗体OriGene Technologies, Inc.AM10031PU-S
波形蛋白抗体AbcamEPR3776
CD90抗体AbcamEPR313
CD73抗体AbcamEPR6114
细胞角蛋白抗体OriGene Technologies, Inc.AM10031PU-S
MTT----
二甲基亚砜Hebei Bio-High Technology Development Co.--
96孔板Costar; Corning, Inc.--
细胞计数试剂盒-8----
茜素红SSigma-Aldrich; Merck KGaA--
ALP检测试剂盒Thermo Fisher Scientific, Inc.--
酶标仪Tecan Group, Ltd.--
TRIzol试剂Qiagen GmbH--
Sensiscript逆转录试剂盒Thermo Fisher Scientific, Inc.--
DSPP抗体Biossbs-10316R
BMP2抗体Biossbs-1012R
DMP1抗体Biossbs-12359R
RUNX2抗体Biossbs-1134R
GelDoc XR凝胶成像系统Bio-Rad Laboratories, Inc.--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
GMSCs分离与培养
组织来源(牙冠延长术患者正常牙龈)、组织剪碎大小(0.5-mm3)、培养基(DMEM+15%胎牛血清)、培养条件(37°C, 5% CO2)
阅读提示:Materials and methods: Isolation and culture of GMSCs
细胞鉴定
抗体克隆号及稀释比例、孵育时间、流式细胞术细胞数
阅读提示:Materials and methods: Flow cytometry for surface marker analysis; Immunofluorescence analysis; Immunohistochemical analysis
增殖检测
细胞代数(第3代)、细胞接种密度(1×10^5 cells/well)、CGF浓度(5%、10%、20%、40%)、处理时间(24,48,72,92 h)
阅读提示:Materials and methods: Cell viability analysis; Cell activity at different concentrations of CGF
成骨分化
细胞接种密度(2×10^4 cells/well)、分组(对照组、纯矿化组、实验组)、CGF浓度(10%)、检测时间点(第7、14、21天)
阅读提示:Materials and methods: Osteogenic differentiation; Alkaline phosphatase (ALP) enzyme activity assay
分子表达检测
第21天收样、引物序列、qPCR条件、抗体浓度及稀释度
阅读提示:Materials and methods: RT-qPCR analysis; Western blot analysis; Table I