GMSCs的分离与培养
从牙龈组织中获得并扩增间充质干细胞。
采集正常牙龈组织,分离上皮层和结缔组织,剪碎后接种于含15%胎牛血清的DMEM培养基中培养,并传代。
Modulation of proliferation and differentiation of gingiva‑derived mesenchymal stem cells by concentrated growth factors: Potential implications in tissue engineering for dental regeneration and repair.
包含细胞分离鉴定、增殖检测、成骨诱导及分子表达验证(RT-qPCR、Western blot),但无动物模型或体内验证,证据层级较为单一。
牙龈间充质干细胞(GMSCs)原代细胞 成骨诱导分化模型(矿化诱导培养基+10% CGF)
细胞来源:患者牙冠延长术中的正常牙龈组织 细胞代数:第3代用于后续实验 CGF浓度:10%是对GMSCs增殖的最佳浓度 分组:对照组(DMEM)、纯矿化组(成骨诱导培养基)、实验组(成骨诱导培养基+10% CGF) 检测时间点:在第7、14、21天检测ALP活性和矿化结节
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
从牙龈组织中获得并扩增间充质干细胞。
采集正常牙龈组织,分离上皮层和结缔组织,剪碎后接种于含15%胎牛血清的DMEM培养基中培养,并传代。
确认所培养的细胞具有间充质干细胞特征。
通过流式细胞术检测表面标记物CD73、CD90、CD105、CD45;免疫荧光和免疫组织化学染色检测vimentin、CD90、S100A4、CD73、细胞角蛋白。
评估不同代数和对不同浓度CGF的GMSCs增殖能力。
MTT法绘制不同代数GMSCs生长曲线;CCK-8法检测不同浓度CGF(5%、10%、20%、40%)处理GMSCs的活性。
验证CGF能否促进GMSCs的成骨分化。
将第3代GMSCs分为三组,分别用DMEM、成骨诱导培养基和成骨诱导培养基+10% CGF培养,通过ALP活性测定和茜素红S染色评估矿化。
探究CGF促进成骨分化的分子机制。
在第21天提取各组细胞RNA和蛋白质,通过RT-qPCR检测DSPP、DMP1、BMP2、RUNX2的mRNA表达,通过Western blotting检测蛋白表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone; GE Healthcare Life Sciences | -- |
| 胎牛血清 | Hangzhou Sijiqing Biological Engineering Materials Co., Ltd. | -- | |
| 细胞传代 | 0.25%胰酶/EDTA溶液 | -- | -- |
| 流式分析 | CD90抗体 | Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd. | H30901-09G |
| CD105抗体 | Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd. | H31051-09H | |
| CD73抗体 | eBioscience | 85-11-0739-41 | |
| CD45抗体 | Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd. | H20451-09G | |
| 流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 免疫荧光 | CD90抗体 | Abcam | EPR313 |
| S100A4抗体 | Abcam | EPR2761(2) | |
| 波形蛋白抗体 | Abcam | EPR3776 | |
| 细胞角蛋白抗体 | OriGene Technologies, Inc. | AM10031PU-S | |
| 免疫组化 | 波形蛋白抗体 | Abcam | EPR3776 |
| CD90抗体 | Abcam | EPR313 | |
| CD73抗体 | Abcam | EPR6114 | |
| 细胞角蛋白抗体 | OriGene Technologies, Inc. | AM10031PU-S | |
| MTT法 | MTT | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | Hebei Bio-High Technology Development Co. | -- | |
| 96孔板 | Costar; Corning, Inc. | -- | |
| 细胞增殖 | 细胞计数试剂盒-8 | -- | -- |
| 成骨分化 | 茜素红S | Sigma-Aldrich; Merck KGaA | -- |
| ALP活性测定 | ALP检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| 酶标仪 | Tecan Group, Ltd. | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Qiagen GmbH | -- |
| 逆转录 | Sensiscript逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| Western blotting | DSPP抗体 | Bioss | bs-10316R |
| BMP2抗体 | Bioss | bs-1012R | |
| DMP1抗体 | Bioss | bs-12359R | |
| RUNX2抗体 | Bioss | bs-1134R | |
| GelDoc XR凝胶成像系统 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GMSCs分离与培养 | 组织来源(牙冠延长术患者正常牙龈)、组织剪碎大小(0.5-mm3)、培养基(DMEM+15%胎牛血清)、培养条件(37°C, 5% CO2) 阅读提示:Materials and methods: Isolation and culture of GMSCs |
| 细胞鉴定 | 抗体克隆号及稀释比例、孵育时间、流式细胞术细胞数 阅读提示:Materials and methods: Flow cytometry for surface marker analysis; Immunofluorescence analysis; Immunohistochemical analysis |
| 增殖检测 | 细胞代数(第3代)、细胞接种密度(1×10^5 cells/well)、CGF浓度(5%、10%、20%、40%)、处理时间(24,48,72,92 h) 阅读提示:Materials and methods: Cell viability analysis; Cell activity at different concentrations of CGF |
| 成骨分化 | 细胞接种密度(2×10^4 cells/well)、分组(对照组、纯矿化组、实验组)、CGF浓度(10%)、检测时间点(第7、14、21天) 阅读提示:Materials and methods: Osteogenic differentiation; Alkaline phosphatase (ALP) enzyme activity assay |
| 分子表达检测 | 第21天收样、引物序列、qPCR条件、抗体浓度及稀释度 阅读提示:Materials and methods: RT-qPCR analysis; Western blot analysis; Table I |