血管内皮生长因子C治疗小鼠后肢淋巴血管重建

Vascular endothelial growth factor C treatment for mouse hind limb lymphatic revascularization.

作者信息Juliana S P Ferrão, Antenor P Bonfim Neto, Vanessa U da Fonseca, Liza M M de C Sousa, Paula de C Papa
PMID30746892
发布时间2019-05
DOI10.1002/vms3.151

实验完整度

包含体内动物模型、免疫组化、体视学、qPCR验证,但缺乏体外或分子机制层面的多重证据。

主要模型

Balb/C雄性小鼠后肢模型

重点核对

切除左侧腹股沟淋巴结及邻近淋巴管 外源性VEGFC(Cys156Ser)腹腔注射0.1 mg mL-1,术后1、5、7、15天 在术后3、9、15、30天处死小鼠 评估LHL近端、中部、远端三个区域的Vv和Lv qPCR检测VEGFC和VEGFR3基因表达

摘要

自发性淋巴血管重建是一个挑战,新的治疗策略的建立可能会改善患有淋巴疾病患者的生活质量。本研究旨在验证VEGFC治疗是否在小鼠后肢(HL)切除腹股沟淋巴结后以时间依赖性方式改善淋巴血管化。通过免疫组织化学后的体视学评估淋巴血管密度(Vv)和长度(Lv)。对照组(CG)未进行手术,但接受生理盐水而非VEGFC治疗。手术组(SG)切除左侧腹股沟淋巴结但未接受VEGFC治疗。VEGFC治疗组(TG)切除淋巴结并接受VEGFC治疗。通过qPCR评估VEGFC和VEGFR3的局部表达。SG中Vv和Lv存在时间效应,且CG和SG在所研究的左侧后肢(LHL)区域(近端、中端和远端)存在显著差异。Lv仅在中间区域显示CG和SG之间的显著差异。TG的Vv和Lv高于其他组。SG和TG的LHL所有区域中,VEGFC和VEGFR3基因表达均表现出时间效应。VEGFC和VEGFR3基因表达在CG和SG、SG和TG以及CG和TG之间均表现出显著差异。这项研究表明,手术切除腹股沟淋巴结及邻近淋巴管后,小鼠左后肢的淋巴血管化显著减少。外源性VEGFC可能通过刺激新生淋巴管生成来恢复淋巴血管化。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
外源性VEGFC治疗是否能够促进小鼠后肢切除腹股沟淋巴结后的淋巴血管重建?
核心机制
外源性VEGFC通过刺激新生淋巴管生成(neolymphangiogenesis)来恢复淋巴血管化。
主要证据
手术切除淋巴结后Vv和Lv显著降低;外源性VEGFC治疗后Vv和Lv升高,且VEGFC和VEGFR3基因表达呈时间依赖性变化。
研究意义
为淋巴水肿和淋巴疾病的治疗提供潜在新策略,可能有助于开发新的淋巴管生成促进方法。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立小鼠后肢淋巴切除模型

评估手术切除腹股沟淋巴结及邻近淋巴管对后肢淋巴血管化的影响。

对小鼠进行左侧腹股沟淋巴结切除术,对照组不进行手术。

2

外源性VEGFC治疗

验证外源性VEGFC是否能促进淋巴血管重建。

对切除淋巴结的小鼠腹腔注射外源性VEGFC(Cys156Ser),浓度0.1 mg mL-1,在术后1、5、7和15天给药。

3

免疫组织化学和体视学分析

定量评估后肢不同区域(近端、中部、远端)的淋巴管密度(Vv)和长度(Lv)。

采集后肢皮肤和肌肉组织,固定、包埋、切片,进行VEGFC和VEGFR3免疫组化染色,然后使用体视学方法分析淋巴管。

4

qPCR检测基因表达

检测后肢不同区域VEGFC和VEGFR3的mRNA表达水平。

从后肢组织提取RNA,进行qPCR分析VEGFC和VEGFR3基因表达,使用β-actin作为内参。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
VEGFC(Cys156Ser)R&D Systems Inc.--
抗VEGFC抗体Bioss Inc.bs-1586R
抗VEGFR3抗体(E-3)Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-514825
TaqMan探针和引物Life Technologies--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型
Balb/C雄性小鼠,2月龄,体重约20g;手术切除左侧腹股沟淋巴结;对照组未手术
阅读提示:实验设计部分
VEGFC治疗
VEGFC剂量0.1 mg mL-1,腹腔注射,术后1、5、7、15天给药
阅读提示:实验设计部分
组织采集和固定
采集左侧后肢近端、中部、远端区域的皮肤和肌肉组织;4%中性福尔马林固定用于免疫组化;液氮速冻后-80°C保存用于qPCR
阅读提示:实验设计部分
免疫组化
VEGFC抗体稀释度1:400,VEGFR3抗体稀释度1:200;阴性对照使用IgG;阳性对照为大鼠肝脏
阅读提示:免疫组织化学部分
体视学分析
使用Stepanizer软件;每只动物每个区域15张5μm切片;Vv = Pp/PT;Lv = 2(N/AT)
阅读提示:体视学部分
qPCR
使用TaqMan探针:VEGFC (Mm01202432_m1),VEGFR3 (Mm00433354_m1),β-actin (Mm00607939_s1);内参基因β-actin
阅读提示:qPCR部分
统计分析
数据正态分布;使用单因素方差分析和Tukey-Kramer事后检验比较多组;使用学生t检验比较两组;显著性水平P < 0.05
阅读提示:统计分析部分