评估MEK1和MEK2缺陷对LPS诱导细胞因子产生的影响
确定MEK1和MEK2在LPS介导的细胞因子产生中的差异作用
使用WT、Mek1d/dSox2Cre和Mek2−/−小鼠来源的BMDMs，用LPS（100 ng/mL）处理24小时，检测NO、TNF-α、IL-10、IL-12、IL-6和IL-1β的产生。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
MEK2通过HIF-1α表达负调控脂多糖介导的IL-1β产生
MEK2 Negatively Regulates Lipopolysaccharide-Mediated IL-1β Production through HIF-1α Expression.
实验完整度
高包含基因敲除小鼠BMDM、siRNA敲低和过表达等体外功能验证以及Western blot、ELISA等机制验证，证据层级丰富。
主要模型
小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM） RAW264.7细胞系
重点核对
BMDMs取自129cc背景的WT、Mek1d/dSox2Cre/+和Mek2−/−小鼠 LPS（055-B5 ultrapure）浓度为100 ng/mL BMDM培养使用含30% L929上清的IMDM培养基 siRNA转染使用HIF-1α siRNA（L-040794-00-0005）或scrambled siRNA池（D-001810-10-05） MEK2过表达使用p3XFLAG-myc-CMV-24载体，转染DNA固定2.5 μg/孔
摘要
LPS激活的巨噬细胞需要缺氧诱导因子（HIF-1）α和葡萄糖转运体（Glut）1表达介导的代谢重编程和葡萄糖摄取，以产生促炎细胞因子，特别是IL-1β。这一过程通过包括MEK/ERK通路在内的丝裂原活化蛋白激酶（MAP）激酶的激活以及包括HIF-1α在内的多种转录因子的激活而受到严格调控。虽然丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）2缺乏对LPS刺激下的一氧化氮、TNF-α和IL-12的产生无显著影响，但MEK2缺陷的鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）表现出较低的IL-10产生。重要的是，MEK2缺陷的BMDM在LPS刺激下表现出保留的ERK1/2磷酸化、更高的HIF-1α、Glut1水平以及显著增加的IL-1β和IL-6产生。通过小干扰RNA（siRNA）敲低HIF-1α表达，降低了MEK2缺陷BMDM中HIF-1α的表达水平，并降低了LPS处理下IL-1β的产生。此外，我们通过在RAW264.7细胞中过表达MEK2蛋白进行了功能获得实验。在RAW264.7细胞中过表达MEK2并用LPS刺激导致IL-1β产生显著减少。最后，我们研究了Mek1和Mek2双重及三重突变对ERK磷酸化、HIF-1α表达和IL-1β产生的作用。我们发现MEK2是主要的激酶，它独立于ERK激活，与HIF-1α和IL-1β的表达呈反比例调节。我们的发现揭示了MEK2在TLR4激活下通过调节HIF-1α表达来调控IL-1β产生的新功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MEK2在LPS刺激的巨噬细胞中对IL-1β产生的作用及其机制是什么？
- 核心机制
- MEK2通过负调控HIF-1α表达来抑制IL-1β的产生，这一过程独立于ERK激活。
- 主要证据
- MEK2缺陷BMDMs在LPS刺激下HIF-1α和IL-1β表达增加，siRNA敲低HIF-1α降低IL-1β产生；MEK2过表达降低IL-1β但ERK磷酸化无显著变化。
- 研究意义
- MEK2可能成为HIF-1α介导的炎症及癌症的新型治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测MEK2缺陷BMDMs中IL-1β和HIF-1α的表达
探究MEK2是否调控IL-1β和HIF-1α的转录和蛋白水平
用LPS处理BMDMs不同时间，通过qRT-PCR检测IL-1β、HIF-1α、ARNT、VEGF的mRNA表达，通过Western blot检测pro-IL-1β、NLRP3、HIF-1α蛋白表达。
分析HIF-1α的核转位和转录活性
验证MEK2缺陷BMDMs中HIF-1α是否在核内积累并具有转录活性
分离核和胞质部分，Western blot检测HIF-1α和pVHL；免疫沉淀HIF-1α后检测p300/CBP共沉淀。
通过siRNA敲低HIF-1α验证其对IL-1β的调控
确定HIF-1α是否为MEK2缺陷BMDMs中IL-1β产生的关键转录因子
MEK2−/− BMDMs转染HIF-1α siRNA或scrambled siRNA，24小时后用LPS处理6或24小时，检测HIF-1α、pro-IL-1β蛋白表达和分泌IL-1β水平。
评估MEK2缺失和过表达对MAPK激活的影响
确定MEK2是否通过ERK通路调控IL-1β，还是独立于ERK
比较WT和MEK2−/− BMDMs在LPS刺激下MEK1/2、ERK、p38和JNK的磷酸化；在RAW264.7细胞中过表达MEK2后检测MEK1/2和ERK磷酸化及pro-IL-1β表达。
研究MEK1/2基因剂量对ERK、HIF-1α和IL-1β的影响
进一步验证MEK2表达的剂量效应及其对IL-1β产生的决定性作用
利用WT、MEK2−/−、1M1L（Mek1f/+Mek2−/−Vav iCre+）和1M2L（Mek1f/fMek2+/−Vav iCre+）小鼠来源的BMDMs，检测ERK磷酸化、HIF-1α表达和IL-1β分泌。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | IMDM培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L929上清 | -- | -- | |
| 药物处理 | 脂多糖（055-B5超纯） | InvivoGen | -- |
| Western blot | 磷酸化MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
| 磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 磷酸化p38抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 磷酸化JNK抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 总ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 总JNK抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 总p38抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| MEK1抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| MEK2抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| VHL抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| Glut1抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| IL-1β抗体 | R&D Systems | -- | |
| HIF-1α抗体 | Bioss Inc | -- | |
| NLRP3抗体 | Adipogen Inc | -- | |
| HRP偶联抗小鼠IgG二抗 | Cell Signaling Technology | -- | |
| HRP偶联抗兔IgG二抗 | Cell Signaling Technology | -- | |
| HRP偶联抗山羊二抗 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| RIPA裂解液 | Millipore | -- | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| 半干转印槽 | Bio-Rad | -- | |
| ECL-Plus化学发光底物 | GE Healthcare | -- | |
| Hyblot CL胶片 | Denville Scientific Inc | -- | |
| ELISA | 小鼠TNF-α DuoSet试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 小鼠IL-1β DuoSet试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| 小鼠IL-12 DuoSet试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| 小鼠IL-10 DuoSet试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| 小鼠IL-6 DuoSet试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| NO检测 | Griess试剂 | -- | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| HIF-1α siRNA | Thermo Scientific | L-040794-00-0005 | |
| 乱序siRNA | Thermo Scientific | D-001810-10-05 | |
| 质粒转染 | Lipofectamine LTX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| p3XFLAG-myc-CMV-24载体 | -- | -- | |
| 免疫沉淀 | ImmunoCruz IP/WB Optima F基质 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Life Technology | -- |
| 逆转录 | 逆转录系统 | Promega | -- |
| qRT-PCR | iQ SYBR Green Supermix试剂 | Life Technology | -- |
| MX3000p实时荧光定量PCR仪 | Stratagene | -- | |
| 统计分析 | SPSS软件 | SPSS Inc | -- |
| Western blot分析 | ImageQuant软件 | Molecular Dynamics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BMDM制备与培养 | 小鼠品系（WT、Mek1d/dSox2Cre/+、Mek2−/−）及背景（129cc），年龄6-12周，培养条件（30% L929上清、10% FBS、5-7天） 阅读提示：参见‘Mice and Isolation of Bone Marrow Derived Macrophages’部分 |
| LPS刺激 | LPS浓度100 ng/mL，处理时间（如24小时、1小时、3小时等） 阅读提示：参见各图注及Results部分 |
| siRNA转染 | siRNA序列或货号（HIF-1α siRNA L-040794-00-0005，scrambled D-001810-10-05），转染试剂Lipofectamine 2000，转染后24小时LPS处理 阅读提示：参见‘Short interference RNA (siRNA) transfection’部分 |
| MEK2过表达 | 质粒构建（p3XFLAG-myc-CMV-24）、转染试剂Lipofectamine LTX、DNA量2.5 μg/孔、转染后24小时LPS处理 阅读提示：参见‘Cell Culture and transfections’部分 |
| Western blot | 抗体名称及供应商、上样量15 μg、PVDF膜、半干转印、封闭条件 阅读提示：参见‘Protein extraction and immunoblotting’部分 |
| ELISA | ELISA试剂盒（R&D DuoKits）种类，细胞培养上清收集时间 阅读提示：参见‘Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)’部分 |