HemSC的分离与鉴定
获得并验证血管瘤来源干细胞
从增殖期IH组织分离细胞，通过CD133磁珠分选，并在纤连蛋白包被的培养板上培养于EGM-2培养基中。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
胰岛素样生长因子2促进血管瘤来源干细胞的脂肪生成
Insulin-like growth factor 2 promotes the adipogenesis of hemangioma-derived stem cells.
实验完整度
中研究包含体外细胞实验，如CCK-8增殖、油红O染色和western blot验证，但未包含动物模型或患者样本的功能验证，属于中等级完整度。
主要模型
HemSCs（血管瘤来源干细胞）
重点核对
IGF-2浓度：100 ng/ml IGF-1R抑制剂OSI-906浓度：1 μM PI3K抑制剂LY294002浓度：10 μM 成脂诱导时间：10天 心得安浓度：25、50、100 μM
摘要
婴幼儿血管瘤（IH）是婴儿中最常见的肿瘤，其特征是快速增殖，随后在儿童期自发消退为纤维脂肪组织。然而，其具体机制尚未阐明。我们之前的研究表明，胰岛素样生长因子2（IGF-2）在IH的增殖期升高，IH被认为由血管瘤来源干细胞（HemSC）形成。然而，IGF-2是否能促进HemSC的成脂分化仍不清楚，所涉及的信号机制有待进一步阐明。在本研究中，采用CCK-8法检测不同浓度IGF-2对HemSC增殖的影响。应用免疫组织化学观察IGF-2及其受体在细胞中的表达。在细胞未处理或用IGF-2或IGF-2加OSI-906诱导10天后，进行油红O染色的脂肪生成。细胞在EGM-2/FBS-10%中单独培养或含有IGF-2、IGF-2加OSI-906或IGF-2加LY294002，并使用western blot分析测定C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、脂联素、p-AKT和总AKT的蛋白表达。在另一个实验中，细胞用25、50或100 μM心得安或载体处理。使用western blot分析或逆转录-定量聚合酶链反应分析C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和IGF-2。结果表明，IGF-2显著促进HemSC的细胞增殖和脂质积累。在IGF-2处理的HemSC培养物中，磷酸化AKT（p-AKT）、C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和脂联素的表达增加，而这些变化被抑制IGF-1受体（IGF-1R）或磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）所抑制。我们之前的研究表明，心得安加速HemSC中的脂肪生成并诱导IGF-2的上调。本研究结果表明，IGF-2能够加速脂肪生成，心得安诱导的失调性脂肪生成的促进可能是由IGF-2通过IGF-1R和PI3K通路介导的。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IGF-2是否促进HemSC的增殖和成脂分化，以及其信号机制是否涉及IGF-1R和PI3K/AKT通路？
- 核心机制
- IGF-2通过IGF-1R和PI3K/AKT通路促进HemSC的成脂分化，上调C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和脂联素的表达。
- 主要证据
- IGF-2处理增强HemSC增殖和脂质积累，油红O染色阳性，western blot显示成脂标志物和p-AKT增加，而OSI-906或LY294002抑制这些效应。
- 研究意义
- 为心得安促进HemSC脂肪生成的机制提供新见解，可能对IH的治疗具有临床意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测IGF-2对HemSC增殖的影响
评估不同浓度IGF-2对细胞增殖的作用
使用CCK-8法检测不同浓度IGF-2处理72小时后细胞的增殖能力，并绘制生长曲线。
检测IGF-2及其受体的表达
确认HemSC中IGF-2及其受体的表达和定位
通过免疫组织化学染色检测IGF-2、IGF-1R、IGF-2R和IR的表达。
评估IGF-2对成脂分化的影响
检测IGF-2是否促进HemSC的成脂分化，并验证IGF-1R的作用
在成脂分化培养基中，用IGF-2或IGF-2加OSI-906处理HemSC 10天，通过油红O染色观察脂滴积累。
检测成脂标志物和AKT磷酸化
验证IGF-2通过IGF-1R/PI3K/AKT通路促进成脂分化
使用western blot检测C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、adiponectin、p-AKT和总AKT的蛋白水平。
检测心得安对HemSC的影响
评估心得安对成脂基因表达和IGF-2表达的影响
用不同浓度心得安处理HemSC，通过RT-qPCR和western blot检测C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和IGF-2的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | EGM-2培养基 | Lonza Group, Ltd. | CC-4176 |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- | |
| 细胞分离 | 胶原酶 | Serva Electrophoresis GmbH | 17454 |
| CD133微珠 | Miltenyi Biotec GmbH | -- | |
| 细胞培养 | 纤连蛋白包被的培养板 | Corning Incorporated | -- |
| 细胞增殖实验 | 胰岛素样生长因子2 | PeproTech, Inc. | 100-12-50UG |
| CCK-8试剂 | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | -- | |
| 酶标仪 | BioTek Instruments, Inc. | ELx 800 | |
| 免疫组织化学 | DAB溶液 | -- | K166724B |
| 成脂分化 | 成脂分化培养基 | Cyagen Biosciences | HUXMF-90031 |
| OSI-906 | Selleck Chemicals | S1091 | |
| Western blot | LY294002 | MedChem Express Co., Ltd. | HY-10108 |
| 抗PPARγ抗体 | BIOSS | bs-0530P | |
| 抗C/EBPα抗体 | BIOSS | bs-1630R | |
| 抗C/EBPβ抗体 | BIOSS | bs-1396R | |
| 抗脂联素抗体 | BIOSS | 0471R | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9271 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9272 | |
| 抗IGF-2抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 25690 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 3700 | |
| 药物处理 | 盐酸心得安 | Sigma-Aldrich | P8688 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript RT试剂 | Takara | -- |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara | -- | |
| Applied Biosystems 7500实时PCR系统 | Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HemSC的培养基组成：EGM-2培养基添加20% FBS和1%青霉素-链霉素；细胞培养在纤连蛋白包被的培养板上 阅读提示：Materials and methods 中 Isolation and identification of HemSCs |
| 增殖实验 | IGF-2浓度（0、10、20、100、200 ng/ml），细胞初始密度（2×10^3），检测时间点（72小时或0-7天） 阅读提示：Materials and methods 中 Proliferation assay 部分 |
| 成脂分化 | 成脂分化培养基（HUXMF-90031），IGF-2浓度100 ng/ml，OSI-906浓度1 μM，处理时间10天 阅读提示：Materials and methods 中 Oil Red O-staining 部分 |
| 信号通路验证 | IGF-2浓度100 ng/ml，OSI-906浓度1 μM，LY294002浓度10 μM，检测蛋白包括p-AKT、总AKT、C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、adiponectin 阅读提示：Materials and methods 中 Western blot analysis 部分 |
| 心得安处理 | 心得安浓度（25、50、100 μM），处理时间（24小时），检测基因和蛋白包括C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、IGF-2 阅读提示：Materials and methods 中 Cell culture and treatment with propranolol 和 RNA isolation and RT-qPCR 部分 |