临床样本收集与炎症分级
获取前列腺组织样本并评估炎症程度
从100名BPH患者中收集前列腺组织，进行H&E染色和炎症分级。
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Toll样受体10（TLR10）对前列腺上皮细胞炎症具有抑制作用
Toll-like receptor 10 (TLR10) exhibits suppressive effects on inflammation of prostate epithelial cells.
实验完整度
高包含患者前列腺组织样本分析、细胞系（RWPE-1）体外模型、siRNA敲低功能验证，并通过组织学、qRT-PCR、Western blot、ELISA等多层级验证。
主要模型
良性前列腺增生患者前列腺组织 RWPE-1前列腺上皮细胞系
重点核对
前列腺组织炎症分级（H&E染色，分级标准参照Supplementary Table 1） LPS刺激浓度2.5 μg ml−1及刺激时间10小时 siRNA敲低TLR2和TLR10的效率（siTLR2-2和siTLR10-2） TLR2、TLR10、HMGB1、phospho-NF-κB P65、IL-6、IL-8的mRNA和蛋白表达水平 样本量：组织qRT-PCR 21例，Western blot 8例
摘要
前列腺炎症（PI）与良性前列腺增生和前列腺癌等慢性前列腺疾病的发生和发展密切相关。已有报道称Toll样受体（TLR）2与感染、自身免疫性疾病和癌症等炎症性疾病相关。同时，能与TLR2形成异二聚体的TLR10被认为是一种孤儿受体，功能尚不明确。因此，本研究旨在探讨TLR2和TLR10对PI的影响。从诊断为良性前列腺增生的患者中获取前列腺样本和临床数据。通过向RWPE-1细胞中添加脂多糖建立炎症细胞模型。采用组织学、分子和生化方法检测前列腺组织/细胞。发现TLR2和TLR10在前列腺组织和RWPE-1细胞中均有表达。TLR2和TLR10的mRNA/蛋白表达水平均与前列腺组织炎症分级呈正相关。与对照细胞相比，脂多糖刺激的RWPE-1细胞表达更高水平的TLR2、TLR10、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、磷酸化核因子κB P65（phospho-NF-κB P65）、白细胞介素（IL）-6和IL-8。此外，在RWPE-1细胞中，TLR2敲低后HMGB1、phospho-NF-κB P65、IL-6和IL-8下调，而TLR10敲低后则上调。TLR2刺激可激活前列腺上皮细胞的炎症信号级联反应。相反，TLR10对炎症表现出抑制作用。TLR2和TLR10具有拮抗功能，均参与PI。TLR10可能成为调节前列腺上皮细胞炎症信号转导的新靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TLR2和TLR10在前列腺炎症中的功能作用是什么？
- 核心机制
- TLR2激活炎症信号通路，而TLR10抑制前列腺上皮细胞炎症。
- 主要证据
- LPS刺激RWPE-1细胞增加炎症因子表达；TLR2敲低降低炎症因子，TLR10敲低升高炎症因子。
- 研究意义
- TLR10可作为调节前列腺上皮细胞炎症信号转导的新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TLR2和TLR10表达定位
确定TLR2和TLR10在前列腺组织和细胞中的表达位置
使用免疫荧光染色检测TLR2和TLR10在前列腺组织及RWPE-1细胞中的表达。
表达与炎症分级相关性分析
评估TLR2、TLR10及炎症因子表达与前列腺炎症分级的关系
通过IHC、qRT-PCR和Western blot检测TLR2、TLR10、HMGB1、phospho-NF-κB P65、IL-6、IL-8的表达，并进行相关性分析。
建立LPS诱导的炎症细胞模型
模拟前列腺上皮细胞炎症环境
用LPS刺激RWPE-1细胞，检测炎症相关分子表达变化。
siRNA敲低TLR2和TLR10的功能验证
验证TLR2和TLR10对炎症因子的调控作用
使用siRNA敲低RWPE-1细胞中TLR2和/或TLR10，检测炎症因子表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织固定和包埋 | 福尔马林 | Sigma-Aldrich Co., Ltd. | -- |
| 组织包埋 | 石蜡 | Leica Biosystems Inc. | -- |
| H&E染色 | 伊红-焰红溶液 | Servicebio Co., Ltd. | -- |
| 中性树胶 | Solarbio Co., Ltd. | -- | |
| 免疫组化 | TLR2抗体 | Novus Biologicals Inc. | NB100-56720 |
| TLR10抗体 | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. | PA5-20054 | |
| HMGB1抗体 | Abcam Inc. | ab18256 | |
| AffiniPure山羊抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch Inc. | -- | |
| 显微镜 | Olympus | -- | |
| 细胞培养 | 角质细胞无血清培养基 | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. | -- |
| 牛垂体提取物 | -- | -- | |
| 人重组表皮生长因子 | -- | -- | |
| 细胞转染 | 脂质体3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. | -- |
| 细胞培养 | 6孔板 | -- | -- |
| 12孔板 | -- | -- | |
| LPS刺激 | 大肠杆菌O55:B5脂多糖 | Sigma-Aldrich Co., Ltd. | -- |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488 驴抗兔IgG (H+L)抗体 | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. | CA21206S |
| Alexa Fluor 594 驴抗小鼠IgG (H+L)抗体 | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. | CA21203S | |
| DAPI染色液 | Sigma-Aldrich Co., Ltd. | -- | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Abcam Inc. | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. | -- |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| TLR2抗体 | Cell Signaling Technology Inc. | 12276 | |
| TLR10抗体 | R&D Systems Inc. | MAB6619 | |
| phospho-NF-κB P65抗体 | Cell Signaling Technology Inc. | 3033T | |
| NF-κB P65抗体 | Cell Signaling Technology Inc. | 8242T | |
| ELISA | 人HMGB1 ELISA试剂盒 | BIOSS Co., Ltd. | bsk00390 |
| 人IL-6 ELISA试剂盒 | NeoBioscience Technology Co., Ltd. | EHC007.96 | |
| 人IL-8 ELISA试剂盒 | NeoBioscience Technology Co., Ltd. | EHC008.96 | |
| 统计分析 | SPSS 22.0统计软件 | SPSS Inc. | -- |
| GraphPad Prism 7.0统计软件 | GraphPad Software Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者组织采集 | BPH患者诊断标准、手术方式（经尿道前列腺等离子切除术）、样本剔除标准（癌症/不典型增生） 阅读提示：Materials and Methods: Data and prostate tissue collection |
| 炎症分级 | H&E染色分级系统，炎症浸润位置和程度分类 阅读提示：Materials and Methods: 炎症分级部分，以及Supplementary Table 1 |
| 免疫组化 | 抗体稀释比例：TLR2 1:400，TLR10 1:500，HMGB1 1:2000；蛋白表达强度判定方法（平均棕色深度） 阅读提示：Materials and Methods: 炎症分级和蛋白表达强度鉴定，以及Figure 3 图注 |
| 细胞培养 | RWPE-1细胞培养条件（37°C，5% CO2），培养基（Keratinocyte-SFM） 阅读提示：Materials and Methods: RWPE-1细胞培养 |
| siRNA敲低 | siRNA序列（siTLR2-2、siTLR10-2），转染试剂（Lipofectamine 3000），转染时间（22 h），细胞密度（1×10^5/孔） 阅读提示：Materials and Methods: RWPE-1细胞培养、RNA干扰；Supplementary Figure 5和6 |
| LPS刺激 | LPS来源（E. coli O55:B5），浓度（2.5 μg ml−1），刺激时间（10 h） 阅读提示：Materials and Methods: LPS刺激部分；Figure 5 图注 |
| qRT-PCR | RNA提取试剂（TRIzol），cDNA合成试剂盒（iScript），引物序列（Supplementary Table 2） 阅读提示：Materials and Methods: 前列腺组织/细胞RNA表达检测；Supplementary Table 2 |
| Western blot | 蛋白裂解液（RIPA），BCA蛋白定量试剂盒，抗体及稀释度（TLR2 1:1000，TLR10 1:250） 阅读提示：Materials and Methods: 前列腺组织/细胞蛋白表达检测 |
| ELISA | ELISA试剂盒种类及货号（HMGB1: bsk00390; IL-6: EHC007.96; IL-8: EHC008.96） 阅读提示：Materials and Methods: ELISA部分 |