鉴定Vip3Aa结合蛋白
利用亲和磁珠法结合质谱鉴定Vip3Aa在Sf9细胞膜上的潜在受体
将生物素标记的Vip3Aa与Sf9细胞膜蛋白孵育，通过链霉亲和素磁珠免疫沉淀，经SDS-PAGE和HPLC-MS/MS鉴定出70种蛋白质，包括Sf-SR-C。
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清道夫受体C作为苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip3Aa的受体并通过内吞作用介导Vip3Aa的内化
Scavenger receptor-C acts as a receptor for Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3Aa and mediates the internalization of Vip3Aa via endocytosis.
实验完整度
高包含体外结合实验（GST pull-down、MST）、离体细胞实验（SR-C敲低、异源表达）、体内实验（幼虫RNAi和转基因果蝇）及内吞机制研究，多个证据层级。
主要模型
Sf9细胞 甜菜夜蛾幼虫 转基因果蝇幼虫（中肠过表达Sf-SR-C） S2细胞（异源表达Sf-SR-C）
重点核对
Vip3Aa与Sf-SR-C的结合亲和力（Kd值） Sf-SR-C敲低对Vip3Aa毒性的影响 Sf-SR-C异源表达增强Vip3Aa毒性 内吞抑制剂对Vip3Aa内化的影响 Sf-SR-C结构域（CCP/MAM）与Vip3Aa的结合
摘要
营养期杀虫蛋白（Vip）由多种苏云金芽胞杆菌菌株在营养生长阶段分泌，与已知的杀虫晶体蛋白（ICPs）在遗传上截然不同，代表了第二代杀虫毒素。与ICPs相比，Vip毒素的杀虫机制知之甚少。特别是，迄今为止尚无关于Vip毒素确切受体的报道。在本研究中，我们通过亲和磁珠法结合HPLC-MS/MS，从草地贪夜蛾（Sf9）细胞膜蛋白中鉴定了与生物素标记的Vip3Aa结合的清道夫受体C类蛋白（Sf-SR-C）。然后我们证实了Vip3Aa原毒素在体外和离体条件下能与Sf-SR-C相互作用。此外，在Sf9细胞和甜菜夜蛾幼虫中肠中下调SR-C的表达降低了Vip3Aa对它们的毒性。巧合的是，在转基因果蝇中肠中异源表达Sf-SR-C显著增强了Vip3Aa对果蝇幼虫的毒力。此外，Sf-SR-C的补体控制蛋白结构域和MAM结构域参与了与Vip3Aa原毒素的相互作用。进一步，由Sf-SR-C介导的Vip3Aa的内吞作用与其杀虫活性相关。我们的结果首次证实Sf-SR-C作为Vip3Aa原毒素的受体，并为Vip3Aa的作用模式提供了见解，这将极大地促进其杀虫机制的研究和应用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Vip3Aa的受体是什么？Sf-SR-C是否作为受体介导其内吞和杀虫活性？
- 核心机制
- Sf-SR-C作为Vip3Aa的受体，通过其CCP和MAM结构域与Vip3Aa结合，介导Vip3Aa通过内吞作用进入细胞，从而发挥杀虫活性。
- 主要证据
- 体外结合实验（GST pull-down、MST）、Sf9细胞SR-C敲低降低毒性、S2细胞异源表达增强毒性、转基因果蝇中肠过表达增加死亡率、内吞抑制剂实验。
- 研究意义
- 首次证实Vip3Aa的受体，阐明其作用模式与Cry毒素不同，支持其作为安全生物杀虫剂的应用，并促进杀虫机制研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证Vip3Aa与Sf-SR-C结合
验证Vip3Aa与Sf-SR-C是否存在特异性相互作用
通过GST pull-down、MST、免疫共沉淀和配体印迹等方法验证Vip3Aa与Sf-SR-C的结合特异性和亲和力。
离体验证Sf-SR-C作为受体
在细胞水平验证Sf-SR-C是否介导Vip3Aa的结合和毒性
通过RNAi敲低Sf9细胞中Sf-SR-C表达，检测Vip3Aa毒性和结合；在S2细胞中异源表达Sf-SR-C，检测Vip3Aa的结合和毒性。
体内验证Sf-SR-C作为受体
在昆虫幼虫水平验证Sf-SR-C是否影响Vip3Aa的杀虫活性
通过饲喂dsRNA敲低甜菜夜蛾幼虫中肠Se-SR-C表达，检测Vip3Aa毒性的变化；构建中肠过表达Sf-SR-C的转基因果蝇，检测Vip3Aa毒性的变化。
鉴定Vip3Aa结合结构域
确定Sf-SR-C中哪些结构域参与与Vip3Aa的结合
将Sf-SR-C胞外序列分为三个片段（SR-F-1、SR-F-2、SR-F-3），通过点印迹和pull-down实验检测与Vip3Aa的结合，并纯化CCP和MAM结构域进一步验证。
验证内吞途径
验证Vip3Aa是否通过内吞进入Sf9细胞，以及Sf-SR-C是否介导此过程
使用内吞抑制剂处理Sf9细胞，检测Vip3Aa-RFP进入细胞的情况；并用抗Sf-SR-C抗体封闭或敲低Sf-SR-C，检测内化变化。
验证内吞与毒性的关系
验证Vip3Aa进入细胞的量与毒性之间的关联
通过使用dynasore抑制内吞，或使用DMSO促进内吞，检测Vip3Aa的毒性和进入细胞数量的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白-蛋白相互作用
检测基因表达
检测细胞活性
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | cOmplete His标签纯化树脂 | Roche | -- |
| GST-琼脂糖亲和层析柱 | GE Healthcare | -- | |
| 蛋白标记 | EZ-Link 硫代-NHS-SS-生物素化试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| 膜蛋白提取 | ProteoExtract跨膜蛋白提取试剂盒 | Novagen | -- |
| 免疫沉淀 | 链霉亲和素磁珠 | GE Healthcare | -- |
| 蛋白G琼脂糖珠 | Santa Cruz | -- | |
| RNA提取 | RNAiso Plus | Takara | -- |
| cDNA合成 | Transcriptor高保真cDNA合成试剂盒 | Roche | -- |
| qRT-PCR | SYBR Premix Ex Taq II | Takara | -- |
| qRT-PCR分析 | StepOne软件 | Applied Biosystems | -- |
| 细胞转染 | Cellfectin II试剂 | Invitrogen | -- |
| PLUS试剂 | Invitrogen | -- | |
| 筛选稳定转染细胞 | zeocin | -- | -- |
| 细胞培养 | Sf-900 II SFM培养基 | Invitrogen | -- |
| SFX-Insect培养基 | HyClone | -- | |
| DAPI | Sigma | -- | |
| FITC-鬼笔环肽 | Sigma | -- | |
| MST分析 | Monolith NT蛋白标记试剂盒 | NanoTemper | L008 |
| NanoTemper Monolith NT.115 Pico | NanoTemper Technologies GmbH | -- | |
| MST数据分析 | MO亲和力分析软件v2.2.2 | NanoTemper | -- |
| Western blotting | Immobilon Western化学发光HRP底物 | Millipore | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 细胞裂解 | RIPA裂解液 | Cell Signaling | 9806S |
| 细胞毒性检测 | CCK-8计数试剂盒 | Dojindo | -- |
| 酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| 显微成像 | Zeiss LSM710共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 转基因果蝇构建 | ClonExpress II一步克隆试剂盒 | Vazyme | -- |
| pJFRC2-10XUAS-IVS-mCD8::GFP质粒 | Addgene | 26214 | |
| 抗体 | 小鼠抗Flag抗体 | Cell Signaling | 8146 |
| 兔抗V5抗体 | Cell Signaling | 13202 | |
| 兔抗His抗体 | Cell Signaling | 12698 | |
| 山羊抗小鼠IgG-HRP偶联物 | Santa Cruz | sc-2005 | |
| 山羊抗兔IgG-HRP偶联物 | Cell Signaling | 7074 | |
| 兔抗GST抗体 | Bioss | bs-2735R | |
| 免疫染色 | 抗V5-Dylight 488偶联物 | Invitrogen | MA5-15253-D488 |
| Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG | Cell Signaling | 4412 | |
| 内吞抑制实验 | dynasore | TargetMol | T1848 |
| 氯丙嗪 | Millipore | 215921 | |
| 单丹磺酰尸胺 | Sigma | D4008 | |
| 制霉菌素 | Millipore | 475914 | |
| 胆固醇氧化酶 | Millipore | 228230 | |
| 阿米洛利 | Millipore | 129876 | |
| 细胞松弛素D | Millipore | 250225 | |
| LY294002 | Cell Signaling | 9901s | |
| 渥曼青霉素 | Cell Signaling | 9951s | |
| 质粒构建 | pEASY-Uni无缝克隆和组装试剂盒 | TransGen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Vip3Aa与Sf-SR-C体外结合实验 | GST-SR-C-N蛋白浓度、Vip3Aa-Flag浓度、MST条件（缓冲液、温度、激光功率）、Kd值计算 阅读提示：Materials and methods: Microscale thermophoresis (MST) assay; Fig 1C-1E |
| Sf9细胞SR-C敲低实验 | 转染试剂、质粒（pIZT-SRi1/pIZT-SRi2）、zeocin筛选浓度、SR-C表达水平验证、Vip3Aa浓度（50 μg/mL）和处理时间（48 h） 阅读提示：Materials and methods: Plasmid construction, transfection, and dsRNA preparation; Fig 2A,2B |
| 甜菜夜蛾幼虫RNAi生物测定 | dsRNA饲喂浓度（细菌数量）、Vip3Aa浓度（0.8 μg/cm2）、幼虫龄期、暴露时间、死亡率记录 阅读提示：Materials and methods: Bioassay - S. exigua; Fig 3A-3C |
| 转基因果蝇生物测定 | 果蝇品系（esgts>SR-Cvk33）、温度控制（29°C/18°C）诱导表达、Vip3Aa浓度（100 μg/mL）、处理时间（48 h）、死亡率记录 阅读提示：Materials and methods: Bioassay - Drosophila; Fig 3D,3E |
| 内吞实验 | 候选内吞抑制剂及浓度、Vip3Aa-RFP浓度和处理时间、共聚焦显微镜定量方法 阅读提示：Materials and methods: Immunostaining and confocal microscopy; Fig 5A,5B |
| Sf-SR-C介导内吞验证 | 抗Sf-SR-C-N抗体浓度及预处理时间、GST-SR-F-1/2与Vip3Aa-RFP比例（20倍过量）、Sf-SRi1/2细胞系 阅读提示：Fig 6A-6D |
| 内吞与毒性关联验证 | dynasore浓度（4 μM）、DMSO浓度（0.6%）、Vip3Aa浓度（50 μg/mL）和处理时间、细胞存活率测定 阅读提示：Fig 7A-7D |