构建Lck-GLK转基因小鼠
研究T细胞中GLK过表达对自身免疫和IL-17A产生的影响
在C57BL/6背景上通过原核显微注射生成T细胞特异性GLK转基因小鼠（Lck-GLK Tg），使用两条独立品系，并验证T细胞中GLK过表达。
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GLK-IKKβ信号诱导AhR-RORγt复合物二聚化及转位，促进IL-17A诱导与自身免疫疾病
GLK-IKKβ signaling induces dimerization and translocation of the AhR-RORγt complex in IL-17A induction and autoimmune disease.
实验完整度
高包含多种转基因/敲除小鼠模型、细胞系实验、生化分析（激酶实验、质谱）、免疫共沉淀及报告基因等，并进行功能验证。
主要模型
T细胞特异性GLK转基因小鼠（Lck-GLK Tg） Jurkat T细胞 HEK293T细胞 PKCθ敲除小鼠、AhR条件敲除小鼠、IKKβ条件敲除小鼠、RORγt条件敲除小鼠
重点核对
Lck-GLK Tg小鼠中GLK过表达特异诱导IL-17A产生 PKCθ磷酸化AhR Ser36并促进其核转位 IKKβ磷酸化RORγt Ser489并诱导AhR-RORγt相互作用 AhR-RORγt复合物结合IL-17A启动子（-877和-254区） TCR信号或GLK过表达诱导IL-17A转录依赖IKKβ和AhR-RORγt
摘要
激酶GLK诱导AhR-RORγt二聚化，导致细胞因子IL-17A的诱导和自身免疫反应。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- GLK过表达如何导致T细胞中IL-17A转录激活及自身免疫疾病？
- 核心机制
- GLK信号通过PKCθ磷酸化AhR Ser36促进其核转位，并通过IKKβ磷酸化RORγt Ser489，诱导AhR-RORγt复合物形成，该复合物结合IL-17A启动子并激活转录。
- 主要证据
- Lck-GLK Tg小鼠自发自身免疫病且血清IL-17A升高；T细胞中PKCθ磷酸化AhR Ser36、IKKβ磷酸化RORγt Ser489及AhR-RORγt相互作用通过co-IP、PLA、激酶实验和质谱验证；ChIP与报告基因显示AhR-RORγt复合物结合IL-17A启动子关键位点。
- 研究意义
- 揭示GLK-PKCθ/IKKβ-AhR/RORγt通路是IL-17A介导自身免疫病的关键机制，提示GLK或AhR-RORγt复合物抑制剂可作为IL-17A阻断剂用于治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
表型分析：自身免疫和细胞因子
确定GLK过表达是否诱导自身免疫表型及哪些细胞因子异常
通过组织学染色、血清自身抗体ELISA、血清细胞因子ELISA评估Lck-GLK Tg小鼠的炎症和自身免疫。
IL-17A的致病性验证
验证IL-17A在自身免疫中的作用
将Lck-GLK Tg小鼠与IL-17A缺陷小鼠杂交，分析血清自身抗体、炎症细胞浸润；并用GLK shRNA敲低T细胞中的GLK，检测IL-17A产生。
IL-17A转录机制研究
确定GLK如何调控IL-17A基因转录
检测IL-17A mRNA水平、IL-17A启动子报告基因活性、ChIP分析转录因子结合，以及突变启动子报告实验。
AhR核转位与磷酸化
研究GLK信号如何促进AhR核转位及其磷酸化机制
通过共聚焦显微镜、亚细胞分离、免疫印迹、体外激酶实验等分析AhR定位和磷酸化，并鉴定激酶为PKCθ。
AhR-RORγt相互作用与核转位
确定AhR是否与RORγt相互作用并介导其核转位
使用共免疫沉淀、PLA、共定位分析、ChIP检测AhR与RORγt的相互作用及RORγt入核，并在AhR KO、PKCθ KO、IKKβ KO背景下验证。
鉴定RORγt磷酸化位点
确定IKKβ磷酸化RORγt的位点并验证其功能
通过体外激酶实验、质谱鉴定RORγt磷酸化位点，生成磷酸化特异性抗体，验证Ser489磷酸化及其对AhR结合的影响。
TCR信号诱导的验证
验证TCR信号是否通过相同通路诱导IL-17A
用抗CD3刺激T细胞，检测RORγt Ser489磷酸化、AhR-RORγt相互作用及IL-17A产生，并使用IKKβ cKO和RORγt cKO小鼠验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
生成基因修饰小鼠
转录活性分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Invitrogen | -- |
| DMEM培养基 | Invitrogen | -- | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | -- | |
| T细胞分离 | 磁珠分选试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| T细胞刺激 | 生物素偶联抗CD3抗体 | -- | -- |
| 链霉亲和素 | -- | -- | |
| 免疫印迹 | 抗GLK抗体（克隆C3） | -- | -- |
| 抗磷酸化AhR(Ser36)抗体 | Assay Biotechnology | A0765 | |
| 抗AhR抗体（克隆RPT9） | Abcam | -- | |
| 抗磷酸化IKKβ(Ser180/181)抗体 | Abcam | ab55341 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab9482 | |
| 抗PKCθ抗体 | Epitomics | 3551-1 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Epitomics | -- | |
| 抗磷酸化PKCθ(Thr538)抗体 | Abcam | ab63365 | |
| 抗磷酸化STAT3(Tyr705)抗体 | Cell Signaling Technology | clone | |
| 抗IKKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2682 | |
| 抗IKKβ抗体 | Cell Signaling Technology | 2678 | |
| 抗磷酸化SGK1(Thr256)抗体 | Cell Signaling Technology | 2939 | |
| 抗SGK1抗体 | Cell Signaling Technology | clone | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9715S | |
| 抗IRF4抗体 | Cell Signaling Technology | 4964S | |
| 抗BATF抗体 | Cell Signaling Technology | 8638S | |
| 抗STAT3抗体 | Millipore | 06-596 | |
| 抗RORγt抗体 | Millipore | clone | |
| 抗KLF4抗体 | R&D Systems | AF3158 | |
| 抗IL-23受体抗体 | Bioss antibodies | bs-1460 | |
| 抗磷酸化RORγt(Ser489)抗体 | -- | -- | |
| 表达构建 | pCMV6-AC-CFP载体 | OriGene Technologies | -- |
| pCMV6-AC-YFP载体 | OriGene Technologies | -- | |
| pCMV6-AC-Myc载体 | OriGene Technologies | -- | |
| pCMV6-AC-HA载体 | OriGene Technologies | -- | |
| pCMV6-AC-Flag载体 | OriGene Technologies | -- | |
| pGEX-4T载体 | -- | -- | |
| 基因敲低 | GLK shRNA | -- | -- |
| pSUPER-GFP载体 | Oligoengine | -- | |
| 报告基因 | pGL4.43-Luc2P-XRE报告载体 | Promega | -- |
| pGL4.47-Luc2P-SIE报告载体 | Promega | -- | |
| pGL4.32-Luc2P-NF-κB-RE-Hygro报告载体 | Promega | -- | |
| pRL-TK内参质粒 | Promega | -- | |
| 蛋白质纯化 | GST-PKCθ重组蛋白 | SignalChem | -- |
| GST-IKKβ重组蛋白 | SignalChem | -- | |
| 6×His-RORγt重组蛋白 | MyBioSource | -- | |
| GST标记AhR重组蛋白 | Abnova | -- | |
| ELISA | IL-17A ELISA试剂盒 | BioLegend | -- |
| 多种细胞因子ELISA试剂盒 | eBioscience | -- | |
| 自身抗体检测 | 自身抗体ELISA试剂盒 | Alpha Diagnostic International | -- |
| 蛋白质相互作用检测 | Duolink原位PLA试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | -- | -- |
| 谷胱甘肽琼脂糖珠 | GE Healthcare | -- | |
| 镍琼脂糖珠 | GE Healthcare | -- | |
| ChIP | 蛋白G磁珠 | Invitrogen | -- |
| PCR纯化 | PCR纯化试剂盒 | GE Healthcare | -- |
| 蛋白质染色 | InstantBlue蛋白染色液 | GeneMark | -- |
| 细胞染色 | 含DAPI封片剂 | GeneTex | -- |
| 驴抗兔IgG-Alexa Fluor 568二抗 | Abcam | -- | |
| 山羊抗小鼠IgG-Alexa Fluor 488二抗 | Life Technologies | -- | |
| 细胞培养 | IL-23重组蛋白 | R&D Systems | -- |
| IL-6重组蛋白 | R&D Systems | -- | |
| TGF-β重组蛋白 | R&D Systems | -- | |
| 抗IL-4抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗IFN-γ抗体 | BioLegend | -- | |
| IL-12重组蛋白 | R&D Systems | -- | |
| Jurkat T细胞系 | ATCC | TIB-152 | |
| HEK293T细胞系 | ATCC | CRL-11268 | |
| 小鼠模型 | AhR条件敲除小鼠 | Jackson Laboratory | JAX |
| IL-17A缺陷小鼠 | Jackson Laboratory | JAX | |
| RORγt条件敲除小鼠 | Jackson Laboratory | JAX | |
| IKKβ条件敲除小鼠 | European Mouse Mutant Archive | EMMA |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | Lck-GLK Tg小鼠构建；与IL-17A缺乏、AhR cKO、PKCθ KO、IKKβ cKO杂交 阅读提示：Methods: Generation of Lck-GLK Tg mice and PKCθ KO mice; Mice; Results |
| 细胞培养与刺激 | Jurkat和HEK293T培养条件；T细胞分离；抗CD3/抗CD28刺激浓度 阅读提示：Methods: Cells; Cell transfections, T cell stimulation |
| 激酶分析 | PKCθ和IKKβ体外激酶实验条件；RORγt Ser489磷酸化检测 阅读提示：Methods: In vitro kinase assays; Results: IKKβ phosphorylates RORγt Ser489 |
| 蛋白质相互作用 | co-IP, PLA, GST/His pulldown, FRET, ALPHA技术条件 阅读提示：Methods: Immunoprecipitation, GST/His pulldown, ALPHA technology, FRET assays, In situ PLA |
| 转录分析 | ChIP引物序列和PCR循环数；报告基因构建和转染；突变位点 阅读提示：Methods: ChIP assays; Luciferase reporter assays; Plasmids and recombinant proteins |
| 细胞因子检测 | ELISA试剂盒品牌和检测方法；血清样本采集和年龄 阅读提示：Methods: Enzyme-linked immunosorbent assays; Figure legends for ELISA data |