桑叶对高脂饮食诱导的实验性高脂血症大鼠的影响

Effects of mulberry leaf on experimental hyperlipidemia rats induced by high-fat diet.

作者信息Jianbo Huang, Yangpeng Wang, Chao Ying, Lei Liu, Zhaohuan Lou
PMID30116313
发布时间2018-08
DOI10.3892/etm.2018.6254

实验完整度

包含动物模型(SD大鼠)及生化、病理、免疫组化和蛋白质印迹等分子验证,但缺乏体外或临床样本的独立验证层级。

主要模型

高脂饮食诱导的高脂血症SD大鼠模型

重点核对

桑叶剂量:0.9、0.6、0.3 g/kg 给药方式:每日口服灌胃 处理时间:5周 动物分组:正常对照组、模型组、阿托伐他汀组、三个桑叶组,每组n=8 主要检测指标:血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT;肝脏和粪便TC、TBA;肝脏蛋白表达

摘要

高胆固醇血症是心血管疾病的主要危险因素。桑叶是一种在临床上用于治疗高脂血症的中药。本研究旨在确定桑叶抗高胆固醇血症的潜在作用和可能靶点。雄性Sprague-Dawley大鼠喂食高脂饮食并用桑叶治疗5周。测量血液脂质水平、肝脏和粪便中的总胆固醇和总胆汁酸水平以评估桑叶对高胆固醇血症的作用。应用Harris苏木素染色和油红O染色观察肝脏的病理变化和脂质蓄积。进行免疫组织化学测定以观察B类I型清道夫受体和低密度脂蛋白受体的表达位置,并应用蛋白质印迹法测定ATP结合盒转运蛋白G5/G8、核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体α、法尼醇X受体和胆固醇7α-羟化酶1的蛋白质表达。结果表明,桑叶处理降低了血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平,以及肝脏总胆固醇和总胆汁酸含量;增加了血清高密度脂蛋白胆固醇水平,以及粪便总胆固醇和总胆汁酸含量;并减轻了肝细胞脂质变性。此外,桑叶处理抑制了肝脏低密度脂蛋白受体、过氧化物酶体增殖物激活受体α和法尼醇X受体的蛋白质表达,促进了胆固醇7α-羟化酶1的蛋白质表达,并维持了ABCG5/ABCG8的比率。本研究的结果表明,桑叶通过法尼醇X受体和胆固醇7α-羟化酶1介导的通路促进胆固醇和总胆汁酸排泄,对胆固醇清除具有积极作用;胆固醇逆转运调节可能是桑叶抗高胆固醇血症的潜在机制。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
桑叶对高胆固醇血症的潜在作用和可能靶点是什么?
核心机制
桑叶通过FXR-和CYP7A1介导的通路促进胆固醇和总胆汁酸排泄,调节胆固醇逆转运(RCT),从而降低血清胆固醇。
主要证据
SD大鼠高脂饮食模型显示,桑叶降低血清TC、LDL-C和肝脏TC、TBA,升高HDL-C和粪便TC、TBA,减轻肝脂变性。Western blot显示桑叶抑制LDL-R、PPARα、FXR表达,促进CYP7A1表达,并维持ABCG5/ABCG8比率。
研究意义
桑叶可作为高胆固醇血症治疗的潜在候选药物,且桑叶可食用,可能用于制茶,为未来预防高脂血症提供便利方法。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立高脂血症动物模型

模拟高脂饮食诱导的高胆固醇血症状态。

雄性SD大鼠随机分为6组,正常组喂食对照饮食,其余各组喂食高脂饮食(含标准饲料82%、猪油10%、胆固醇1%、胆酸盐1%和蛋黄粉5%)5周。

2

桑叶和阿托伐他汀给药处理

评估桑叶对高脂饮食大鼠血脂及相关指标的影响,并比较阳性对照药物。

正常和模型组灌胃蒸馏水,阿托伐他汀组灌胃6.0 mg/kg阿托伐他汀,桑叶组分别灌胃0.9、0.6、0.3 g/kg桑叶,每日一次,持续5周。

3

血清和肝脏生化指标检测

评估桑叶对血脂水平及肝功能的改善作用。

采集大鼠腹主动脉血,分离血清,用全自动生化分析仪检测TC、TG、HDL-C、LDL-C、AST、ALT。制备肝脏匀浆,用ELISA试剂盒检测肝组织TC、TG和TBA水平。

4

粪便TC和TBA测定

评估桑叶对胆固醇和胆汁酸粪便排泄的影响。

收集粪便样本,干燥后用无水乙醇超声提取,离心分离上清,用ELISA试剂盒测定TC和TBA水平。

5

肝脏组织病理学和脂质沉积评估

观察桑叶对肝脏病理变化和脂质蓄积的改善作用。

肝组织固定、包埋、切片,进行H&E染色和油红O染色,在光学显微镜下观察病理变化和脂滴积累。

6

免疫组化检测定位

确定SR-BI和LDL-R在肝脏中的表达位置。

肝组织切片进行免疫组化染色,使用SR-BI和LDL-R一抗孵育,二抗和DAB显色,光学显微镜下观察棕色阳性区域。

7

蛋白质印迹检测蛋白表达

定量分析胆固醇吸收、转化和排泄相关蛋白的表达水平。

提取肝脏总蛋白,经SDS-PAGE电泳、转膜、封闭,与一抗和二抗孵育,ECL显色,以GAPDH为内参定量蛋白表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
桑叶粉Shaoxing Royal Tea Village Co., Ltd.--
阿托伐他汀China Meheco Group Co., Ltd.--
高脂饮食Trophic Animal Feed High-tech Co., Ltd.--
总胆固醇生化检测试剂盒Medicalsystem Biotechnology Co., Ltd15110401
甘油三酯生化检测试剂盒Medicalsystem Biotechnology Co., Ltd15090101
高密度脂蛋白胆固醇生化检测试剂盒Medicalsystem Biotechnology Co., Ltd15091401
低密度脂蛋白胆固醇生化检测试剂盒Medicalsystem Biotechnology Co., Ltd15100703
天冬氨酸氨基转移酶生化检测试剂盒Medicalsystem Biotechnology Co., Ltd15092901
丙氨酸氨基转移酶生化检测试剂盒Medicalsystem Biotechnology Co., Ltd15092401
甘油三酯酶联免疫吸附测定试剂盒Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute15090101
总胆固醇酶联免疫吸附测定试剂盒Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute20151127
总胆汁酸酶联免疫吸附测定试剂盒Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute20151128
全自动血液生化分析仪 (TBA-40FR)Toshiba Medical Systems CorporationTBA-40FR
PowerWave 340 酶标仪BioTek Instruments, Inc.--
超声波仪 (KQ-500DE)Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.KQ-500DE
油红OSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.WSIG20100803
Harris苏木素Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute20151216
光学显微镜 (B5-223IEP)Motic China Group Co., Ltd.B5-223IEP
SR-BI抗体Abcamab52629
LDL-R抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-11824
小鼠和兔特异性HRP/DAB(ABC)检测免疫组化试剂盒Abcamab64264
RIPA裂解液Beyotime Institute of BiotechnologyP0013B
蛋白质定量试剂盒Beyotime Institute of BiotechnologyP0012
PPARα抗体ProteinTech Group, Inc.15540-1-AP
SR-BI抗体Abcamab52629
LDL-R抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-11824
ABCG5抗体BIOSSbs-5013R
ABCG8抗体BIOSSbs-10149R
FXR抗体ImmunoWay Biotechnology CompanyNR1H4,
CYP7A1抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-14426
GAPDH抗体Sangon Biotech Co., Ltd.B661204-0001
HRP标记兔抗鼠IgG二抗Cell Signaling Technology, Inc.58802
增强化学发光检测试剂GE Healthcare--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型建立
雄性SD大鼠,6-8周龄,体重180-200g;高脂饮食成分(标准饲料82%、猪油10%、胆固醇1%、胆酸盐1%、蛋黄粉5%);喂养时间5周;每组n=8
阅读提示:Methods: Animals and treatments
药物干预
桑叶剂量(0.9、0.6、0.3 g/kg);阿托伐他汀剂量(6.0 mg/kg);给药方式(口服灌胃);给药频率(每日一次);给药时间(5周)
阅读提示:Methods: Animals and treatments
血清生化检测
血液离心条件(206 × g,15 min,4°C);检测指标(TC、TG、HDL-C、LDL-C、AST、ALT);使用全自动生化分析仪
阅读提示:Methods: Biochemical analysis and liver TC, TG and TBA assay
肝脏和粪便脂质检测
肝脏匀浆制备方法(0.5 g组织加4.5 ml无水乙醇);离心条件(825 × g,10 min);粪便提取方法(0.3 g粉末加3.4 ml无水乙醇,超声处理);检测指标(TC、TG、TBA)
阅读提示:Methods: Biochemical analysis and liver TC, TG and TBA assay; Fecal TC and TBA levels determination
蛋白质印迹
蛋白提取方法(~100 mg肝组织,RIPA裂解);离心条件(18,246 × g,15 min,4°C);上样量(50 µg/lane);一抗及稀释比例(PPARα、SR-BI、LDL-R、ABCG5、ABCG8、FXR、CYP7A1、GAPDH均1:1,000);二抗稀释比例(1:1,000);内参(GAPDH)
阅读提示:Methods: Western blot analysis