猪牙花减轻卵清蛋白诱导的哮喘小鼠模型中的肺组织病理学异常

Erythronium japonicum attenuates histopathological lung abnormalities in a mouse model of ovalbumin-induced asthma.

作者信息Ji-Hye Seo, Mi-Ae Bang, Gyeyeop Kim, Seung Sik Cho, Dae-Hun Park
PMID27035741
发布时间2016-05
DOI10.3892/ijmm.2016.2541

实验完整度

高

包含OVA诱导哮喘动物模型、BALF细胞与IgE检测、组织病理学、免疫组化及HPLC成分分析等多个独立证据层级,且明确包含功能验证和机制验证。

主要模型

雌性BALB/c小鼠OVA诱导哮喘模型 OVA致敏和攻击的BALB/c小鼠

重点核对

雌性BALB/c小鼠(5周龄,n=80) OVA致敏剂量:20 µg OVA和1 mg氢氧化铝水合物腹腔注射,在第1天和第8天进行 5% OVA雾化攻击30分钟,在第21至25天进行 猪牙花提取物口服剂量:60和600 mg/kg/天

摘要

哮喘是一种慢性肺部疾病,可诱导黏液过度分泌和肺阻塞,甚至可能导致死亡,尤其是在儿童和老年人中。猪牙花(E. japonicum)是韩国和东亚国家使用的一种传统草药,已被发现具有清除自由基活性和对人结直肠癌细胞的抗增殖作用。在本研究中,我们评估了猪牙花提取物在卵清蛋白(OVA)诱导的哮喘小鼠模型中的抗哮喘作用。雌性BALB/c小鼠在第1天和第8天通过腹腔注射OVA和氢氧化铝水合物致敏,然后在第21至25天接受以下治疗:i) 对照组(不治疗),ii) 灭菌自来水(口服),iii) 1 mg/kg/天地塞米松(口服),iv) 60 mg/kg/天猪牙花提取物,和v) 600 mg/kg/天猪牙花提取物。在同一天,除对照组外,所有小鼠在1小时后用雾化5% OVA攻击30分钟。我们发现,猪牙花提取物处理抑制了OVA诱导的白细胞数量增加,并降低了小鼠支气管肺泡灌洗液样本中的IgE水平。肺组织的组织病理学分析显示,猪牙花减轻了哮喘相关的小鼠肺组织形态学变化,包括细支气管中黏液分泌增加、细支气管和血管周围的嗜酸性粒细胞浸润,以及杯状细胞和上皮细胞增生。免疫组织化学分析显示,猪牙花提取物处理抑制了OVA诱导的小鼠肺组织中辅助性T细胞(CD4+)和B细胞(CD19+)的增殖。此外,猪牙花提取物处理调节了辅助性T细胞2型相关因子[GATA结合蛋白3(GATA-3)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-4、IL-5、IL-6和IL-13]以及辅助性T细胞1型相关因子[干扰素-γ(IFN-γ)、IL-12p35和IL-12p40]的表达。这些发现表明,猪牙花可能作为抗哮喘治疗药物。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
猪牙花提取物是否能在卵清蛋白诱导的哮喘小鼠模型中发挥抗哮喘作用?
核心机制
猪牙花提取物可能通过调节Th1/Th2细胞相关因子的平衡来改善哮喘症状。
主要证据
猪牙花提取物处理抑制了OVA诱导的白细胞和IgE增加,减轻了肺组织病理学改变,减少了CD4+、CD8+和CD19+细胞数量,并调节了Th1和Th2相关细胞因子的表达(如降低GATA-3、IL-4、IL-13等,增加IFN-γ)。
研究意义
研究表明猪牙花是治疗哮喘的潜在候选药物,但需要进一步研究以完善对其潜在作用和机制的理解。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立OVA诱导的哮喘小鼠模型

建立哮喘动物模型以评估猪牙花的抗哮喘作用。

雌性BALB/c小鼠用OVA和氢氧化铝水合物腹腔注射致敏,然后用雾化OVA攻击,并给予不同处理(对照组、水对照组、地塞米松组、猪牙花提取物低剂量和高剂量组)。

2

评估BALF中白细胞和IgE水平

评估猪牙花对OVA诱导的气道炎症指标的影响。

收集支气管肺泡灌洗液,计数总白细胞和分类白细胞,并用ELISA检测IgE水平。

3

组织病理学分析

评估猪牙花对OVA诱导的肺组织形态学改变的影响。

肺组织经固定、包埋、切片,进行H&E和PAS染色,观察黏液分泌、嗜酸性粒细胞浸润、杯状细胞和上皮细胞增生。

4

免疫组织化学分析

定量肺组织中CD4+、CD8+、CD19+细胞及Th1/Th2相关因子的表达。

免疫组织化学染色检测CD4、CD8、CD19、T-bet、GATA-3、IFN-γ、IL-12p35、IL-12p40、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6和IL-13阳性细胞。

5

HPLC分析猪牙花提取物成分

鉴定猪牙花提取物中的潜在活性化合物。

使用HPLC分析猪牙花提取物,鉴定出绿原酸和咖啡酸。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
卵清蛋白Sigma-Aldrich--
氢氧化铝水合物Sigma-Aldrich--
雾化器Omron Co. Ltd.NE-U17
Hemavet多物种血液学系统Drew Scientific, Inc.--
小鼠IgE ELISA试剂盒Abnova--
ZoletinVirbac--
大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体eBioscience14-9766
大鼠抗小鼠CD8单克隆抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-18913
兔抗小鼠CD19多克隆抗体Abbiotec250585
兔抗小鼠Tbx21/T-bet多克隆抗体Biossbs-3599R
山羊抗小鼠GATA-3抗体OriGeneTA305795
大鼠抗小鼠IFN-γ单克隆抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-74104
山羊抗小鼠IL-12p35多克隆抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-9350
大鼠抗小鼠IL-12p40单克隆抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-57258
兔抗小鼠TNF-α多克隆抗体BioVision3053R-100
大鼠抗小鼠IL-4单克隆抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-73318
兔抗小鼠IL-5多克隆抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-7887
兔抗小鼠IL-6多克隆抗体AbnovaPAB16165
山羊抗小鼠IL-13多克隆抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-1776
生物素化二抗Dako--
高效液相色谱系统Agilent Technology--
Zorbax extend-C18色谱柱----
甲醇J.T. Baker--
咖啡酸Sigma-Aldrich--
绿原酸Sigma-Aldrich--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型建立
小鼠品系、性别、年龄、数量;致敏剂量和途径;攻击浓度和时间;给药剂量和途径
阅读提示:Materials and methods: Establishment of a mouse model of OVA-induced asthma
BALF分析
灌洗液体积、离心条件、细胞计数方法、IgE检测方法
阅读提示:Materials and methods: Analysis of bronchoalveolar lavage fluid (BALF)
组织病理学分析
组织固定、包埋、切片厚度、染色方法
阅读提示:Materials and methods: Histopathological analysis
免疫组织化学分析
一抗浓度和孵育条件、抗原修复方法、阳性细胞计数方法
阅读提示:Materials and methods: Immunohistochemical analysis
HPLC分析
色谱柱规格、流动相、梯度、检测波长
阅读提示:Materials and methods: HPLC analysis