经皮经肝门静脉栓塞术后肝萎缩分两个组织学阶段:肝细胞萎缩期随后凋亡期

Liver atrophy after percutaneous transhepatic portal embolization occurs in two histological phases: Hepatocellular atrophy followed by apoptosis.

作者信息Yasuhito Iwao, Hidenori Ojima, Tatsushi Kobayashi, Yoji Kishi, Satoshi Nara, Minoru Esaki, Kazuaki Shimada, Nobuyoshi Hiraoka, Minoru Tanabe, Yae Kanai
PMID29184609
发布时间2017-11-18
DOI10.4254/wjh.v9.i32.1227

实验完整度

研究包含猪模型和人类标本的病理学分析,包括形态学测量、TUNEL、IHC和电镜,但样本量小,缺乏Western blot验证。

主要模型

猪PTPE模型(雌性家猪) 人PTPE后肝切除标本

重点核对

PTPE后观察时间点(第0天、第2周、第4周、第6周) 栓塞叶与非栓塞叶对照的样本采集 门静脉至中央静脉距离(PV-CV)和小叶面积测量 TUNEL阳性细胞比例用于凋亡评估 LC3和LAMP2免疫组化染色强度

摘要

目的:阐明猪和人经皮经肝门静脉栓塞(PTPE)后肝萎缩相关的组织学变化。方法:作为初步研究,我们对五头猪的肝标本进行了病理检查,这些猪在肝萎缩时间依赖性模型中接受了PTPE。在栓塞叶(EMB)和非栓塞叶(对照)标本中,我们测量了门静脉至中央静脉距离(PV-CV)、每个肝小叶的面积和肝细胞数量,并使用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记测定法评估凋亡活性。对微管相关蛋白1轻链3(LC3)和溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)作为自噬标志物,谷氨酰胺合成酶和细胞色素P450 2E1(CYP2E1)作为代谢分区标志物进行了免疫组织化学反应性评估。PTPE后20-36天取样的十个人肝脏样本同样进行了检查。结果:在第0天,EMB和对照之间的PV-CV和小叶面积没有差异,但在第2、4和6周,EMB低于对照(P≤0.001)。在第0天和第2周,EMB中肝细胞数量没有显著减少,但在第4周和第6周减少(P≤0.05)。在第0天和第4周,EMB的凋亡活性高于对照。LC3和LAMP2染色在第2周在EMB中达到峰值,在第4周和第6周EMB与对照之间没有显著差异。EMB在第2、4和6周的谷氨酰胺合成酶和CYP2E1分区比对照窄。人类结果与猪标本一致。结论:PTPE后肝萎缩的机制分为两个组织学阶段:肝细胞萎缩在前2周可能由自噬引起,之后由凋亡引起。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
PTPE后肝萎缩的机制是什么?是否随时间呈现不同组织学阶段?
核心机制
PTPE后肝萎缩经历两个阶段:前2周为肝细胞萎缩期,可能由自噬引起;第2至4周为凋亡期,伴随自噬标志物减少和凋亡增加。
主要证据
猪PTPE模型显示第2周肝小叶缩小而肝细胞数量未减少,LC3和LAMP2表达升高;第4周肝细胞数量减少而小叶大小不变,TUNEL阳性细胞增加;人类标本结果与猪第4周类似。
研究意义
该研究为理解门静脉血流中断后肝萎缩机制提供基础,并可能有助于制定急性门静脉阻塞相关肝功能障碍或慢性缺血性肝病伴萎缩的治疗策略。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立PTPE动物模型

建立时间依赖的肝萎缩猪模型以研究门静脉栓塞后肝萎缩的组织学变化。

对五头猪在荧光引导下行分段PTPE,注射10 mL无水乙醇,分别在第0天、第2周、第4周和第6周处死,取得肝脏标本。

2

形态学测量

比较栓塞叶和非栓塞叶在肝小叶水平上的形态差异。

对HE染色切片测量PV-CV距离和肝小叶横截面积,计算每个肝小叶的肝细胞数量和密度。

3

凋亡活性评估

定量检测栓塞叶和非栓塞叶肝细胞的凋亡水平。

使用TUNEL染色,在10个随机高倍视野中计数TUNEL阳性肝细胞比例,重复五次。

4

自噬标志物检测

评估自噬标志物LC3和LAMP2的表达变化。

通过免疫组化染色检测LC3和LAMP2表达,使用ImageJ分析强度,并以门管区神经作为阳性对照。

5

代谢分区评估

观察栓塞叶内代谢分区标志物GS和CYP2E1的分布变化。

通过免疫组化染色检测谷氨酰胺合成酶和CYP2E1的表达分布,评估分区范围。

6

电子显微镜观察

确认自噬泡的形态学证据。

对福尔马林固定猪肝标本进行透射电镜观察,在80 kV下检查肝细胞细胞器。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
21-G针Top--
5-Fr鞘Medikit--
选择球囊导管Terumo Clinical Supply--
无水乙醇Fuso Pharmaceutical Industries--
原位细胞死亡检测试剂盒,PODRoche Diagnostic--
聚合物系统Dako--
LC3抗体Santa Cruz Biotechnologysc-271625
LAMP2抗体Biossbs-2379R
GS抗体MilliporeMAB302
CYP2E1抗体Biossbs-4562R
Nanozoomer数字病理系统Hamamatsu Photonics--
日立H-7650Hitachi--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
PTPE动物模型
猪的品种、体重、PTPE具体操作(如栓塞材料、注射剂量)、观察时间点
阅读提示:Materials and Methods - Animal specimens
形态学分析
PV-CV距离测量方法、小叶面积和细胞计数标准
阅读提示:Materials and Methods - Morphological study of the lobule
凋亡检测
TUNEL试剂盒型号、检测步骤、阳性细胞计数方法
阅读提示:Materials and Methods - Evaluation of apoptotic activity
免疫组化
抗体稀释度、抗原修复条件、染色强度量化方法
阅读提示:Materials and Methods - Immunohistochemical staining
电子显微镜
电镜型号、固定条件、观察参数
阅读提示:Materials and Methods - Electron microscopy