MSCs的分离与培养
从不同组织来源（髂嵴骨髓、脂肪、RIA）获取并扩增间充质干细胞，以获得足够数量的细胞用于后续实验。
从10 ml髂嵴骨髓中直接培养ICBM-MSCs；用胶原酶消化脂肪组织获得Ad-MSCs；用Ficoll梯度离心分离RIA-MSCs。所有细胞在含有FBS和抗生素的DMEM培养基中培养。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
间充质干细胞中趋化因子受体的表达：不同来源和传代次数的比较分析
Chemokine Receptors Expression in MSCs: Comparative Analysis in Different Sources and Passages.
实验完整度
中包含细胞分离培养、流式鉴定、分化诱导、RT-PCR和迁移实验等体外功能验证，但缺乏体内实验或患者样本验证。
主要模型
髂嵴骨髓来源的间充质干细胞(ICBM-MSCs) 脂肪组织来源的间充质干细胞(Ad-MSCs) 扩孔-冲洗-吸引器来源的间充质干细胞(RIA-MSCs) 人真皮成纤维细胞(HDF)作为对照
重点核对
细胞来源：ICBM、Ad、RIA，各来自3个不同供体 传代次数：P2和P3 CXCR4抑制剂AMD3100处理浓度：5 μg/ml SDF-1α浓度：100 ng/ml 迁移实验时间：18小时
摘要
基于间充质干细胞(MSC)的疗法正在为未满足医疗需求的退行性疾病提供治疗，临床通常应用髂嵴骨髓(ICBM)。包括脂肪组织和扩孔/冲洗/吸引器在内的替代来源在分离MSCs方面具有很大潜力。本研究比较了脂肪组织(Ad-MSCs)、长骨骨髓(RIA-MSCs)和髂嵴骨髓来源的原始MSCs特征，以及这三种来源中与归巢相关的趋化因子受体(包括CXCR4、CX3CR1、CXCR6、CXCR2、CCR1和CCR7)的表达。我们进一步利用Transwell迁移实验研究了SDF-1/CXCR4轴作为不同MSCs群体运动性的关键作用。所有细胞均表现出典型的MSCs特征。然而，不同来源的MSCs表达不同水平的趋化因子受体。总体上，这些趋化因子受体的表达随传代次数(P)从2到3的增加而降低。有趣的是，在P2时，Ad-MSCs中CXCR4的表达和迁移能力显著高于ICBM和RIA-MSCs。尽管我们的数据显示P2 Ad-MSCs中CXCR4表达最高，但在P3亚培养后其表达急剧下降。因此，为通过趋化因子/受体轴改善MSCs的归巢，在临床应用时应考虑分离来源和传代次数。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 不同来源的间充质干细胞在趋化因子受体表达和迁移能力上是否存在差异，以及这些差异是否随传代次数变化，从而影响其归巢能力和临床适用性。
- 核心机制
- SDF-1/CXCR4轴是调控间充质干细胞迁移和归巢的关键通路，尤其在P2 Ad-MSCs中高表达CXCR4并介导显著迁移，但该表达在P3显著下降。
- 主要证据
- 通过流式细胞术、成骨和成脂分化实验、RT-PCR和Transwell迁移实验证明，P2 Ad-MSCs具有最高的CXCR4表达和SDF-1诱导的迁移能力，且AMD3100能抑制该迁移。
- 研究意义
- 研究提示，在临床应用中选择合适的MSC来源和传代次数对于优化细胞归巢和提高治疗效果至关重要，Ad-MSCs在P2可能具有归巢优势。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MSCs的特征鉴定
验证所得细胞是否为间充质干细胞，具备典型的表面标记物表达和多向分化能力，并排除成纤维细胞污染。
通过流式细胞术检测CD90、CD105、CD73、CD44等阳性标记物和CD11b、CD34、CD45等阴性标记物；进行成骨和成脂分化诱导，并通过茜素红S染色、ALP活性测定和油红O染色评估分化能力；同时比较不同来源细胞的形态和群体倍增时间。
趋化因子受体的表达谱分析
比较不同来源和传代次数的MSCs中与归巢相关的趋化因子受体的表达水平，筛选具有高归巢潜力的细胞群。
提取RNA，通过RT-PCR和实时定量PCR检测CXCR4、CXCR2、CXCR6、CX3CR1、CCR1和CCR7的mRNA表达水平。以ICBM-MSCs的表达为基准，比较P2和P3时各来源细胞的表达差异。
迁移能力评估
验证不同来源和传代次数的MSCs对SDF-1α的趋化迁移能力，并确认该迁移依赖于CXCR4。
使用Transwell迁移实验（8 μm孔径），将未处理或AMD3100处理的MSCs置于上室，下室加入SDF-1α或含10% FBS的培养基作为阳性对照。培养18小时后染色并计数迁移细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 低糖DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 细胞分离 | I型胶原酶 | Invitrogen | -- |
| 牛血清白蛋白 | Biowest | -- | |
| 细胞培养 | 碱性成纤维细胞生长因子 | Royan Institute | -- |
| 细胞分离 | Ficoll-Hypaque梯度 | Cederlan | -- |
| 流式细胞术 | 抗CD34抗体 | -- | -- |
| 小鼠抗CD44抗体 | Antibodies-online | -- | |
| 兔抗CD45抗体 | -- | -- | |
| 兔抗CD105抗体 | Bioss Inc | -- | |
| 兔抗CD11b抗体 | -- | -- | |
| 小鼠抗CD73抗体 | -- | -- | |
| 小鼠抗CD90抗体 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 胰蛋白酶/EDTA | -- | -- |
| 细胞计数 | 台盼蓝 | -- | -- |
| RT-PCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| M-MULV逆转录酶 | fermentase | -- | |
| 凝胶红 | Biotium | -- | |
| 实时定量PCR | Syber green通用预混液 | Pars tous | -- |
| 迁移实验 | AMD3100 | Sigma-Aldrich | -- |
| SDF-1α | Peprotech | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 24孔8 μm孔径聚碳酸酯膜 | Costar, corning | -- | |
| 成骨分化 | 地塞米松 | Sigma-Aldrich | -- |
| β-甘油磷酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抗坏血酸-2-磷酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 成脂分化 | 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 油红O | -- | -- | |
| 统计分析 | Graph Pad Prism 6.0版本 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MSCs的分离与培养 | 不同来源的MSCs的分离方法和培养条件，包括ICBM-MSCs、Ad-MSCs、RIA-MSCs和HDF的具体操作步骤 阅读提示：Materials and Methods中的Isolation of human MSCs from different sources部分 |
| MSCs的特征鉴定 | 用于流式细胞术的表面标记物抗体、分化诱导培养基的成分和染色方法，以及群体倍增时间的计算 阅读提示：Materials and Methods中的Flow cytometry、Adipogenic and osteogenic differentiation和Population doubling time (PDT)部分 |
| 趋化因子受体的表达谱分析 | 用于RT-PCR和实时PCR的引物序列、反应条件和仪器，以及使用的内参基因 阅读提示：Materials and Methods中的RT-PCR、Real time PCR部分和Table 1 |
| 迁移能力评估 | Transwell迁移实验的细胞数量、AMD3100和SDF-1α的浓度、孵育时间和计数方法 阅读提示：Materials and Methods中的Migration assays部分 |