生成条件性ELL2敲除小鼠
研究ELL2在前列腺中的功能作用
通过将Ell2loxp/loxp小鼠与probasin-Cre4小鼠杂交，获得前列腺上皮细胞特异性ELL2敲除小鼠，并通过PCR确认基因型。
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条件性删除ELL2诱导小鼠前列腺上皮内瘤变
Conditional deletion of ELL2 induces murine prostate intraepithelial neoplasia.
实验完整度
高包含基因敲除小鼠模型、组织病理学分析、免疫组化、微阵列及qPCR验证、细胞实验（siRNA敲低和雄激素处理）以及癌症基因组学数据分析等多个证据层级。
主要模型
ELL2条件性敲除小鼠（Ell2-cko） C4-2前列腺癌细胞系 LNCaP前列腺癌细胞系
重点核对
ELL2条件性敲除小鼠的基因型（通过PCR确认） 小鼠年龄（17-20个月龄） 野生型与Ell2-cko小鼠的比较 Ki-67增殖标记检测 CD31微血管密度检测
摘要
延伸因子，RNA聚合酶II，2（ELL2）是一种RNA Pol II延伸因子，其功能特性与ELL相似，可相互作用于前列腺肿瘤抑制因子EAF2。在前列腺中，ELL2是一个雄激素反应基因，在前列腺增生（BPH）中上调。我们最近发现，ELL2缺失可增强前列腺癌细胞的增殖和迁移，并且ELL2基因表达在高Gleason评分的前列腺癌标本中下调。在此，小鼠模型中前列腺特异性缺失ELL2揭示了ELL2在体内可能作为前列腺肿瘤抑制因子的作用。Ell2敲除小鼠表现出前列腺缺陷，包括上皮增殖增加、血管增加和PIN病变，类似于先前确定的Eaf2敲除小鼠的前列腺表型。对C57BL/6J背景下3月龄Ell2敲除和野生型小鼠的前列腺进行微阵列分析，并在17月龄时进行qPCR验证，揭示了大量与增殖、细胞运动以及上皮和神经分化相关的差异表达基因。OncoPrint分析确定了来自癌症基因组图谱（TCGA）数据门户的前列腺腺癌病例中同时下调或缺失。这些结果表明，ELL2及其通路基因可能在前列腺癌的发展和进展中发挥重要作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ELL2在前列腺中的功能及其在肿瘤发生中的作用是什么？
- 核心机制
- ELL2缺失导致HIF1α表达增加，可能与EAF2和ELL的功能重叠有关，从而调节前列腺血管生成和细胞增殖。
- 主要证据
- ELL2敲除小鼠表现出前列腺上皮增生、mPIN、微血管密度增加；微阵列和qPCR显示多个基因表达改变；C4-2细胞中ELL2敲低增加HIF1α蛋白水平。
- 研究意义
- ELL2可能作为前列腺肿瘤抑制因子，其缺失促进前列腺癌的发生和发展，为前列腺癌的机制研究提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
组织病理学分析
评估ELL2缺失对前列腺组织学的影响
对17-20个月龄雄性小鼠的前列腺进行固定、切片、HE染色，并由病理学家盲法评估上皮增生、间质增生和mPIN。
增殖和血管密度检测
评估ELL2缺失对细胞增殖和血管生成的影响
通过Ki-67免疫组化评估上皮细胞增殖，通过CD31免疫组化评估微血管密度。
基因表达分析
识别ELL2缺失引起的基因表达改变
对3个月龄小鼠前列腺进行cDNA微阵列分析，并用17个月龄小鼠前列腺进行qPCR验证。
细胞实验
验证ELL2缺失对细胞增殖和蛋白表达的影响
在LNCaP细胞中敲低ELL2检测增殖，在C4-2细胞中检测R1881对ELL2表达的影响以及ELL2敲低对HIF1α蛋白水平的影响。
癌症基因组学数据分析
评估ELL2及其靶基因在患者中的改变频率
利用cBioPortal分析两个前列腺癌数据集（神经内分泌和TCGA）中ELL2及其潜在靶基因的改变。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
组学分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 原位杂交 | pBluescript II SK质粒载体 | -- | -- |
| T3 RNA聚合酶 | Promega Corp. | -- | |
| T7 RNA聚合酶 | Promega Corp. | -- | |
| 蛋白提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA质量分析 | Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| 微阵列 | 小鼠基因组430 2.0基因芯片 | Affymetrix Inc. | -- |
| qPCR验证 | RNeasy小提试剂盒 | Qiagen | -- |
| qPCR | SYBR Green/ROX | Thermo Scientific | -- |
| Applied Biosystems StepOne™Plus™实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Corning cellgro | 10-040-CV |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| R1881 | -- | -- | |
| 免疫印迹 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | -- |
| 抗ELL2抗体 | Bethyl Laboratories, Inc. | A302-505A | |
| HIF1α抗体 | BD Transduction Laboratories | 610959 | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc25778 | |
| siRNA敲低 | siELL2 | Integrated DNA Technologies | -- |
| siEAF2 | Integrated DNA Technologies | -- | |
| siSCR（对照siRNA-A） | Santa Cruz | sc-37007 | |
| DharmaFECT™转染试剂 | GE Healthcare | -- | |
| 免疫组化 | 抗ELL2抗体 | Bioss Antibodies | bs-6993R |
| 抗Ki-67抗体 | Dako | M7249 | |
| 抗CD31抗体 | BD Biosciences | 550274 | |
| 图像采集 | 徕卡DM LB显微镜 | Leica Microsystems Inc. | -- |
| QImaging MicroPublisher 3.3 RTV相机 | QImaging | -- | |
| 图像分析 | Aperio ScanScope CS扫描仪 | Aperio | -- |
| Aperio ImageScope软件 | Aperio Technologies, Inc. | -- | |
| Photoshop CS | Adobe Systems | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 4 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因敲除小鼠生成 | Ell2loxp/loxp小鼠与probasin-Cre4小鼠的杂交；基因型通过PCR验证；小鼠背景C57BL/6J 阅读提示：Methods部分-生成前列腺特异性ELL2缺失小鼠 |
| 组织病理学分析 | 小鼠年龄：17-20个月；组织固定于10%福尔马林；切片厚度5μm；HE染色 阅读提示：Methods部分-组织病理学分析 |
| 增殖和血管密度检测 | Ki-67免疫组化；CD31免疫组化；小鼠数量（至少6只/组）；视野数量（至少20个） 阅读提示：Methods部分-免疫组化 |
| 基因表达分析 | 3个月龄小鼠各6只用于微阵列；17个月龄WT n=5，Ell2-cko n=3用于qPCR；内参基因GAPDH 阅读提示：Methods部分-组织制备和微阵列杂交，基因表达验证 |
| 细胞实验 | LNCaP和C4-2细胞培养条件；R1881浓度范围；siRNA敲低条件 阅读提示：Methods部分-细胞培养实验 |