双调蛋白抗体与实验性近视中眼轴伸长的减少

Amphiregulin Antibody and Reduction of Axial Elongation in Experimental Myopia.

作者信息Wen Jun Jiang, Hui Xin Song, Shao Yu Li, Bin Guo, Jian Feng Wu, Guo Ping Li, Da Dong Guo, De Long Shi, Hong Sheng Bi, Jost B Jonas
PMID28256400
发布时间2017-03
DOI10.1016/j.ebiom.2017.02.021

实验完整度

包含动物模型、眼内注射、生物测量、组织形态计量、免疫组化及qPCR,但缺乏体外或患者样本等多层级验证。

主要模型

豚鼠透镜诱导近视模型 豚鼠原发性近视模型 豚鼠正常正视模型

重点核对

豚鼠年龄2-3周,体重100-150g 透镜诱导近视:-10 D透镜粘贴于眼眶2周 双调蛋白抗体剂量:5、10、15 μg(体积5 μL) 注射间隔9天,共3次 对侧眼注射林格氏液对照

摘要

为了探讨近视眼中眼轴伸长的机制,对2-3周龄的豚鼠进行了实验,这些豚鼠要么接受了单侧或双侧透镜诱导的近视化(第1组),要么在基线时已经近视(第2组),分别接受三次间隔9天的双调蛋白抗体(剂量:5、10或15 μg)单侧眼内注射。第三组为正视豚鼠,接受双调蛋白(剂量分别为0.25、0.50或1.00 ng)单侧眼内注射。每组中对侧眼接受林格氏液眼内注射。在组1和组2的动物内眼间比较和眼内随访比较中,研究眼与对侧眼相比,轴性伸长呈剂量依赖性减少。在第3组中,研究眼和对照眼在轴性伸长方面没有显著差异。免疫组织化学显示,在透镜诱导近视化并注射林格氏液的眼中,视网膜色素上皮层有双调蛋白标记,但在注射双调蛋白抗体的眼中没有。双调蛋白抗体的眼内注射导致幼年豚鼠透镜诱导的轴性近视伸长和生理性眼球增大的减少。相反,眼内注射剂量≤1 ng的双调蛋白未显示显著效果。双调蛋白可能是眼轴伸长的几个必需分子因子之一。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
双调蛋白是否参与实验性近视中的眼轴伸长及其机制?
核心机制
双调蛋白可能通过促进视网膜色素上皮产生Bruch膜,从而参与眼轴伸长。
主要证据
在透镜诱导近视的豚鼠中,玻璃体腔注射双调蛋白抗体剂量依赖性减少眼轴伸长,并降低视网膜中双调蛋白的mRNA和蛋白表达。
研究意义
阻断双调蛋白可能具有预防轴性近视进展的潜力,但需进一步验证。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立豚鼠近视模型

诱导透镜性近视或利用原发性近视豚鼠,模拟近视发展过程

对2-3周龄豚鼠进行单侧或双侧透镜诱导近视化(-10 D透镜粘贴2周),或选用基线屈光度至少-2 D的原发性近视豚鼠。

2

眼内注射双调蛋白抗体或双调蛋白

评估双调蛋白抗体或双调蛋白对眼轴伸长的影响

对模型眼进行玻璃体腔注射,注射双调蛋白抗体(5、10、15或20 μg)或双调蛋白(0.25、0.50、1.00 ng),对侧眼注射林格氏液。

3

眼轴长度测量

监测眼轴长度的变化,评估治疗效果

在基线和每次注射前及实验结束时,使用A/B型超声生物测量仪测量眼轴长度、前房深度、晶状体厚度和玻璃体腔长度。

4

组织学检查与形态测量

评估巩膜厚度变化及排除炎症

实验结束后处死动物,取眼球进行PAS染色,光镜下测量巩膜厚度,并检查有无炎症细胞浸润。

5

免疫组织化学检测双调蛋白表达

定位双调蛋白在视网膜中的表达,并验证抗体阻断效果

冰冻切片,使用兔抗双调蛋白抗体进行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察。

6

实时定量PCR检测mRNA表达

检测视网膜组织中双调蛋白和EGFR的mRNA表达水平

提取视网膜总RNA,反转录,SYBR Green实时定量PCR检测双调蛋白、EGFR和β-actin的mRNA表达。

7

统计分析

比较各组间差异,评估剂量效应

使用SPSS进行配对t检验、非配对t检验,比较研究眼与对侧眼及组间差异。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
A/B型超声扫描仪Quantel Co.--
双调蛋白抗体R&D Systems, Bio-Techne Co.AF989
双调蛋白R&D Systems, Bio-Techne Co.989-AR
林格氏液Otsuka, China Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.--
汉密尔顿微量注射器Sigma-Aldrich701 ASRN
PAS染色试剂盒Solarbio Co.--
希夫试剂----
中性树胶----
Trizol试剂Invitrogen15596026
反转录试剂盒Takara6210A
SYBR Green I 预混液Roche4707516001
兔抗双调蛋白抗体Biossbs-3847R
山羊抗兔IgG H&L 555Abcamab150078
DAPI----
LSM 780激光共聚焦显微镜Zeiss--
SPSS for Windows 22.0版IBM-SPSS--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型
豚鼠年龄2-3周,体重100-150g;透镜诱导近视化用-10 D透镜粘贴于眼眶2周;原发性近视组基线屈光度至少-2 D
阅读提示:Methods - Animals and Experimental Design
眼内注射
双调蛋白抗体剂量5、10、15 μg或20 μg,体积5 μL;双调蛋白剂量0.25、0.50、1.00 ng,体积5 μL;注射间隔9天(抗体)或7天(双调蛋白),共3次;对侧眼注射林格氏液
阅读提示:Methods - Animals and Experimental Design
眼轴测量
超声频率11 MHz,测量参数包括眼轴长度、前房深度、晶状体厚度、玻璃体腔长度;测量时间点包括基线、每次注射前、实验结束
阅读提示:Methods - Animals and Experimental Design
组织学检查
PAS染色步骤、切片厚度8 μm、测量部位(后极和赤道与后极中点)
阅读提示:Methods - Light-microscopical Histomorphometry
免疫组织化学
一抗浓度、孵育时间、二抗稀释度、核染色时间、显微镜设置
阅读提示:Methods - Immunohistochemistry
qPCR
RNA提取量、引物序列、PCR循环参数、内参基因、相对定量方法
阅读提示:Methods - Quantitative Real-time PCR