建立豚鼠近视模型
诱导透镜性近视或利用原发性近视豚鼠,模拟近视发展过程
对2-3周龄豚鼠进行单侧或双侧透镜诱导近视化(-10 D透镜粘贴2周),或选用基线屈光度至少-2 D的原发性近视豚鼠。
Amphiregulin Antibody and Reduction of Axial Elongation in Experimental Myopia.
包含动物模型、眼内注射、生物测量、组织形态计量、免疫组化及qPCR,但缺乏体外或患者样本等多层级验证。
豚鼠透镜诱导近视模型 豚鼠原发性近视模型 豚鼠正常正视模型
豚鼠年龄2-3周,体重100-150g 透镜诱导近视:-10 D透镜粘贴于眼眶2周 双调蛋白抗体剂量:5、10、15 μg(体积5 μL) 注射间隔9天,共3次 对侧眼注射林格氏液对照
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
诱导透镜性近视或利用原发性近视豚鼠,模拟近视发展过程
对2-3周龄豚鼠进行单侧或双侧透镜诱导近视化(-10 D透镜粘贴2周),或选用基线屈光度至少-2 D的原发性近视豚鼠。
评估双调蛋白抗体或双调蛋白对眼轴伸长的影响
对模型眼进行玻璃体腔注射,注射双调蛋白抗体(5、10、15或20 μg)或双调蛋白(0.25、0.50、1.00 ng),对侧眼注射林格氏液。
监测眼轴长度的变化,评估治疗效果
在基线和每次注射前及实验结束时,使用A/B型超声生物测量仪测量眼轴长度、前房深度、晶状体厚度和玻璃体腔长度。
评估巩膜厚度变化及排除炎症
实验结束后处死动物,取眼球进行PAS染色,光镜下测量巩膜厚度,并检查有无炎症细胞浸润。
定位双调蛋白在视网膜中的表达,并验证抗体阻断效果
冰冻切片,使用兔抗双调蛋白抗体进行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察。
检测视网膜组织中双调蛋白和EGFR的mRNA表达水平
提取视网膜总RNA,反转录,SYBR Green实时定量PCR检测双调蛋白、EGFR和β-actin的mRNA表达。
比较各组间差异,评估剂量效应
使用SPSS进行配对t检验、非配对t检验,比较研究眼与对侧眼及组间差异。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 眼轴测量 | A/B型超声扫描仪 | Quantel Co. | -- |
| 药物处理 | 双调蛋白抗体 | R&D Systems, Bio-Techne Co. | AF989 |
| 双调蛋白 | R&D Systems, Bio-Techne Co. | 989-AR | |
| 对照注射 | 林格氏液 | Otsuka, China Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | -- |
| 注射 | 汉密尔顿微量注射器 | Sigma-Aldrich | 701 ASRN |
| 组织染色 | PAS染色试剂盒 | Solarbio Co. | -- |
| 希夫试剂 | -- | -- | |
| 中性树胶 | -- | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| 反转录 | 反转录试剂盒 | Takara | 6210A |
| qPCR | SYBR Green I 预混液 | Roche | 4707516001 |
| 免疫组化 | 兔抗双调蛋白抗体 | Bioss | bs-3847R |
| 山羊抗兔IgG H&L 555 | Abcam | ab150078 | |
| DAPI | -- | -- | |
| LSM 780激光共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 统计分析 | SPSS for Windows 22.0版 | IBM-SPSS | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 豚鼠年龄2-3周,体重100-150g;透镜诱导近视化用-10 D透镜粘贴于眼眶2周;原发性近视组基线屈光度至少-2 D 阅读提示:Methods - Animals and Experimental Design |
| 眼内注射 | 双调蛋白抗体剂量5、10、15 μg或20 μg,体积5 μL;双调蛋白剂量0.25、0.50、1.00 ng,体积5 μL;注射间隔9天(抗体)或7天(双调蛋白),共3次;对侧眼注射林格氏液 阅读提示:Methods - Animals and Experimental Design |
| 眼轴测量 | 超声频率11 MHz,测量参数包括眼轴长度、前房深度、晶状体厚度、玻璃体腔长度;测量时间点包括基线、每次注射前、实验结束 阅读提示:Methods - Animals and Experimental Design |
| 组织学检查 | PAS染色步骤、切片厚度8 μm、测量部位(后极和赤道与后极中点) 阅读提示:Methods - Light-microscopical Histomorphometry |
| 免疫组织化学 | 一抗浓度、孵育时间、二抗稀释度、核染色时间、显微镜设置 阅读提示:Methods - Immunohistochemistry |
| qPCR | RNA提取量、引物序列、PCR循环参数、内参基因、相对定量方法 阅读提示:Methods - Quantitative Real-time PCR |