LSD1抑制剂的设计与合成
获得三唑-二硫代氨基甲酸酯杂合体库，并筛选对LSD1有抑制活性的化合物。
通过点击化学方法合成了一系列1,2,3-三唑-二硫代氨基甲酸酯杂合体（化合物12-95），并测定了其对重组LSD1的抑制活性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
基于三唑-二硫代氨基甲酸酯的选择性赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）灭活剂抑制胃癌细胞生长、侵袭和迁移
Triazole-dithiocarbamate based selective lysine specific demethylase 1 (LSD1) inactivators inhibit gastric cancer cell growth, invasion, and migration.
实验完整度
高包含体外酶活性测定、细胞活性与功能实验、分子机制研究及体内异种移植瘤模型，且具备功能验证和机制验证。
主要模型
人胃癌细胞系MGC-803 人胃癌细胞系HGC-27 人胃癌细胞系SGC-7901 人正常胃上皮细胞系GES-1 MGC-803细胞裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
LSD1过表达胃癌细胞系MGC-803和HGC-27 化合物26浓度（0.5、2.5、12.5 μM）和时间（60 min）对LSD1活性抑制的影响 化合物26的细胞毒性IC50值（MGC-803: 0.89 μM; HGC-27: 1.13 μM） 化合物26在体内异种移植瘤模型中给药剂量（5、10、20 mg/kg）和给药方式（静脉注射，每日一次，共21天） siRNA介导的LSD1敲低对细胞活力和迁移侵袭的影响
摘要
赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）是第一个被鉴定的组蛋白去甲基化酶，在基因激活和抑制的表观遗传调控中发挥重要作用。已有报道LSD1在多种恶性肿瘤中表达上调。在本研究中，我们设计并合成了五个系列的1,2,3-三唑-二硫代氨基甲酸酯杂合体，并筛选了它们对LSD1的抑制活性。我们发现其中一些化合物，特别是化合物26，对LSD1表现出最特异和有效的抑制。有趣的是，与2-PCPA相比，化合物26还对过表达LSD1的胃癌细胞系MGC-803和HGC-27表现出有效和选择性的细胞毒性，并显著抑制细胞迁移和侵袭。此外，化合物26有效减少了人胃癌细胞在体内裸鼠中的肿瘤生长，且无明显副作用。这些发现提示化合物26值得作为治疗LSD1过表达胃癌的先导化合物进行进一步研究。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 设计并合成三唑-二硫代氨基甲酸酯杂合体，评估其作为LSD1抑制剂对LSD1过表达胃癌细胞的抗肿瘤作用。
- 核心机制
- 化合物26通过竞争性结合LSD1的FAD结合位点，可逆地抑制LSD1活性，导致H3K4和H3K9甲基化水平升高，上调E-钙粘蛋白表达，降低LSD1与snail的相互作用，从而抑制细胞迁移和侵袭。
- 主要证据
- 体外酶活性测定表明化合物26对LSD1的IC50为2.1μM，MST实验显示Kd为0.35μM；细胞实验表明化合物26选择性抑制LSD1过表达胃癌细胞活力，诱导凋亡，并抑制迁移和侵袭；体内异种移植瘤实验显示20mg/kg剂量显著抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 化合物26作为先导化合物值得进一步研究，可能开发为针对LSD1过表达胃癌的新型抗癌表观遗传药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外LSD1抑制活性及选择性评估
评估化合物对LSD1的抑制效力、结合亲和力以及对LSD1同源物的选择性。
对化合物进行体外LSD1活性抑制测定，对活性最好的化合物26进行了MST实验测定Kd值，并检测其对LSD2、MAO-A、MAO-B的抑制活性。
细胞水平活性验证
验证化合物26在细胞内的LSD1抑制活性及其对胃癌细胞的选择性毒性。
在不同胃癌细胞系和正常胃上皮细胞中检测化合物26的细胞毒性（MTT法），并检测组蛋白甲基化水平变化以确认LSD1被抑制。
细胞凋亡、迁移和侵袭实验
评估化合物26对胃癌细胞凋亡、迁移和侵袭的影响。
通过Hoechst 33258染色和Annexin V-FITC/PI双染流式检测凋亡；通过划痕实验、Transwell实验评估迁移和侵袭，并通过Western blot和免疫共沉淀检测相关蛋白表达和相互作用。
体内抗肿瘤效果评估
验证化合物26在体内对胃癌肿瘤生长的抑制作用及安全性。
建立MGC-803细胞裸鼠异种移植瘤模型，给予不同剂量化合物26，监测肿瘤体积、重量和体重。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
合成化学
体外酶活性测定
体内实验
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 化学合成 | X-5显微熔点仪 | -- | -- |
| Bruker 400 MHz核磁共振波谱仪 | Bruker | -- | |
| Nicolet iS10红外光谱仪 | Nicolet | -- | |
| Waters Micromass Q-T of Micromass质谱仪 | Waters | -- | |
| Dionex UltiMate 3000超高效液相色谱仪 | ThermoFisher | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 细胞活性检测 | MTT | -- | 298-93-1 |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX试剂 | Invitrogen | -- |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| H3K4me抗体 | Selleck Chemicals | A1237 | |
| H3K4me2抗体 | Epitomics | 1347-1 | |
| H3K9me2抗体 | Epitomics | 1349-1 | |
| H3K4me3抗体 | Bioss | bs-4715R | |
| H3抗体 | Sino Biological Inc | 100005-MM01 | |
| LSD1抗体 | Epitomics | 5890-1 | |
| E-钙粘蛋白抗体 | Epitomics | 1702-1 | |
| Snai1抗体 | Cell Signaling | 3879 | |
| GAPDH抗体 | GoodHere | AB-M-M | |
| 免疫沉淀 | 交联免疫沉淀试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| 组蛋白提取 | 组蛋白纯化试剂盒 | Epigentek | -- |
| 蛋白质印迹 | 增强化学发光试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| 凋亡检测 | Hoechst-33258 | -- | 23491-45-4 |
| AnnexinV-FITC/PI染色试剂盒 | Biovision | -- | |
| 流式分析 | Accuri C6流式细胞仪 | BD | -- |
| MST实验 | Monolith NT.115 | NanoTemper Technologies | -- |
| 细胞培养 | 二甲基亚砜 | -- | 67-68-5 |
| 动物实验 | 羟丙基-β-环糊精 | -- | 128446-35-5 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LSD1活性抑制测定 | LSD1重组蛋白来源和浓度，底物H3K4me2浓度，反应时间，抑制剂浓度范围 阅读提示：Methods: Inhibitory Evaluation of the Synthesized Compounds Against LSD1, LSD2, MAO-A, MAO-B and Mechanism of Action Studies |
| 细胞毒性测定 | 细胞系（MGC-803, HGC-27, SGC-7901, GES-1），细胞密度，化合物浓度范围，处理时间，MTT检测时间点 阅读提示：Methods: Cells and Cell Viability Assay; Figure 7 |
| 细胞凋亡检测 | 化合物26浓度，处理时间（48h），Hoechst染色浓度，流式检测方法 阅读提示：Methods: Apoptotic Analysis; Figure 8 |
| 迁移和侵袭实验 | 细胞密度，划痕工具，化合物26浓度，处理时间（48h），Transwell小室孔径和基质胶浓度 阅读提示：Methods: Migration and Invasion Assay; Figure 9 |
| 体内异种移植瘤实验 | 小鼠品系（BALB/C nude mice），细胞接种数，肿瘤体积起始大小（100 mm3），给药剂量（5, 10, 20 mg/kg）、给药方式（i.v.）、给药频率（每日一次）、给药周期（21天），对照组设置（saline, HP-β-CD） 阅读提示：Methods: Xenograft Studies; Figure 10 |