牙上皮和牙间充质细胞片的制备与优化
确定生成DE和DM细胞片的最佳细胞接种密度和培养时间。
将猪原代DE和DM细胞以不同密度（0.02、0.114、0.228×10^6 cells/cm²）接种于温度响应型培养板，培养7、14、21天，观察细胞形态和自发脱落情况。
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牙科细胞片仿生牙胚模型
Dental cell sheet biomimetic tooth bud model.
实验完整度
高包含细胞片制备与优化、体外3D构建体培养、体内大鼠皮下植入、micro-CT和组织学及免疫组化分析等多个独立实验层级。
主要模型
猪原代牙上皮（DE）和牙间充质（DM）祖细胞 体外3D GelMA-牙科细胞片（CSG）仿生牙胚构建体 免疫缺陷大鼠皮下植入模型
重点核对
DE和DM细胞片制备的细胞接种密度和时间（DM 0.11×10^6 cells/cm²，DE 0.22×10^6 cells/cm²，14天） GelMA浓度（3%和5%）及光交联条件（9.16 W/cm² UV，20秒） 体外成骨培养基培养时间（4天） 体内植入时间（3周）和动物品系（5月龄雌性Rowett Nude大鼠）
摘要
组织工程和再生医学技术为医学和牙科提供了有前景的治疗方法。我们的长期目标是创建功能性仿生牙胚，最终用于人类牙齿替换。在此，我们的目标是创建一个由牙上皮（DE）-牙间充质（DM）细胞片（CSs）结合使用GelMA水凝胶创建的仿生釉质器官和牙髓器官层组成的仿生3D牙胚模型。将猪DE或DM细胞以不同细胞密度（0.02、0.114和0.228×10^6 cells/cm²）接种在温度响应型培养板上，并培养7、14和21天，分别用于生成DE和DM细胞片。将牙科CSs与GelMA包封的DE和DM细胞层结合，形成生物工程化的3D牙胚。将仿生3D牙胚构建体在体外培养，或体内植入3周。使用显微CT、H&E染色、偏振光（Pol）显微镜、免疫荧光（IF）和免疫组织化学（IHC）分析进行分析。H&E、IHC和IF分析显示，体外培养的多层DE-DM CSs表达了适当的牙齿标志物表达模式，包括SHH、BMP2、RUNX2、tenascin和syndecan，这些通常指导DE-DM相互作用、DM细胞凝聚和牙科细胞分化。体内植入的3D牙胚构建体表现出特定大小和形状的矿化组织形成，以及SHH、BMP2和RUNX2和牙科细胞分化标志物表达。我们提出我们的仿生3D牙胚作为研究优化的DE-DM细胞相互作用的模型，这些相互作用导致功能性仿生替换牙的形成。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何构建包含牙上皮和牙间充质细胞片的仿生3D牙胚模型，以促进DE-DM细胞相互作用和牙齿再生？
- 核心机制
- DE-DM细胞片层间的相互作用通过FAK、TEN、SYN4等粘附分子和SHH、BMP2、RUNX2等信号通路介导，促进牙科细胞分化和矿化组织形成。
- 主要证据
- 体外培养的CSG构建体表达SHH、BMP2、RUNX2等信号分子，体内植入后形成特定大小和形状的矿化组织，并表达DSPP、OC、AM等分化标志物。
- 研究意义
- 该模型有助于研究DE-DM细胞相互作用，为开发具有特定大小和形状的功能性生物工程化替换牙提供新工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
多层细胞片构建
通过堆叠单层细胞片形成多层DE-DM细胞片，以模拟天然牙发育中的上皮-间充质相互作用。
将脱落的DE和DM细胞片小心堆叠，形成两层DM和三层DE细胞片，并通过H&E染色验证多层结构。
3D GelMA-细胞片牙胚构建体的体外制备
将DE-DM细胞片整合到包含GelMA水凝胶的仿生牙胚结构中，并在体外培养以评估细胞活力和相互作用。
将DM细胞包封在5% GelMA中，光交联后覆盖DE和DM细胞片，再包封DE细胞在3% GelMA中并光交联，形成双层结构。构建体在成骨培养基中培养24小时、4、7、12天。
体外培养构建体的表征
评估体外培养的3D构建体中细胞片组织、胶原沉积、细胞活力和相互作用。
通过H&E染色、偏振光显微镜和免疫荧光分析检查细胞片形态、胶原组织和VM、CK18表达。
体内植入3D牙胚构建体
评估体内环境中构建体形成矿化组织和牙科细胞分化的能力。
将体外培养4天的构建体皮下植入免疫缺陷大鼠背部，3周后取材，进行micro-CT、组织学和免疫组织化学分析。
体内构建体矿化组织分析
定量和定性分析体内形成的矿化组织的体积、密度和分布。
使用micro-CT扫描构建体，通过CT-Analyser软件计算矿物密度，并分析不同密度矿化组织的体积百分比和位置。
组织学和免疫组织化学分析
评估体内构建体中的细胞类型、细胞外基质形成和牙科细胞分化标志物表达。
脱钙、石蜡包埋、切片后，进行H&E、天狼星红染色、偏振光检查，以及IHC分析DSPP、OC、AM、AMBN、TEN、SYN4等标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | LHC-8培养基 | GIBCO | -- |
| Advanced DMEM/F12培养基 | GIBCO | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素-两性霉素B | -- | -- | |
| 抗坏血酸 | -- | -- | |
| Glutamax添加剂 | -- | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| T175 cm²培养瓶 | Corning Inc. | -- | |
| 细胞片制备 | UpCell温度响应型培养板 | CellSeed | -- |
| 构建体制备 | 甲基丙烯酰化明胶 | -- | -- |
| Irgacure 2959光引发剂 | Sigma | -- | |
| Omnicure S2000紫外光固化系统 | Lumen Dynamics Group Inc. | -- | |
| 成骨诱导 | 地塞米松 | -- | -- |
| β-甘油磷酸 | -- | -- | |
| 动物实验 | Rowett裸鼠 | Charles River Laboratories | -- |
| 组织固定 | 福尔马林 | -- | -- |
| 组织处理 | Dulbecco磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
| micro-CT | SkyScan 1076显微CT | Bruker | -- |
| micro-CT分析 | CT-Analyser软件 | Bruker | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | -- | -- |
| 组织化学染色 | 天狼星红 | Polysciences | -- |
| 免疫荧光 | 抗细胞角蛋白18抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-28264 |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | Antibodies Online | ABIN1858334 | |
| 抗RUNX2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-10758 | |
| 抗音猬因子抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9024 | |
| 抗骨形态发生蛋白2抗体 | Abcam | AB14933 | |
| 抗CD31抗体 | LifeSpan BioSciences Inc | LS-B5577 | |
| 抗波形蛋白抗体 | Bioss | BS-0756R | |
| 驴抗小鼠IgG-Alexa Fluor 488二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 515-545-003 | |
| 驴抗兔IgG-Alexa Fluor 568二抗 | Invitrogen | A11011 | |
| DAPI封片剂 | Vector Laboratories | H-1500 | |
| 免疫组织化学 | 抗骨钙素抗体 | Abcam | ab13418 |
| 抗牙本质涎磷蛋白抗体 | Genetex | GTX60194 | |
| 抗粘着斑激酶抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-557 | |
| 抗多配体蛋白聚糖-4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-33912 | |
| 抗腱生蛋白C抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-20932 | |
| 抗成釉蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-33102 | |
| 抗釉原蛋白抗体 | Millipore | ABT260 | |
| 生物素-SP偶联二抗 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| ABC试剂 | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| DAB显色液 | Sigma | D4293 | |
| 组织学染色 | 固绿 | Sigma | F7252 |
| 显微镜 | Zeiss Axiophot Imager显微镜 | Zeiss | -- |
| 图像处理 | AxioVision软件 | Zeiss | -- |
| Adobe Photoshop | Adobe | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞片制备 | 细胞来源（猪5月龄未萌出磨牙牙胚）、细胞密度（DE 0.22×10^6 cells/cm²，DM 0.11×10^6 cells/cm²）、培养时间（14天）、温度响应型培养板（UpCell） 阅读提示：Materials and methods: Dental cell sheet fabrication |
| 3D构建体制备 | GelMA浓度（3%和5%）、细胞密度（3×10^7 cells/ml）、光交联条件（9.16 W/cm² UV，20秒）、细胞片层叠顺序 阅读提示：Materials and methods: Creation of 3D tooth bud constructs |
| 体外培养 | 成骨培养基组成（地塞米松100 nM、β-甘油磷酸10 mM、抗坏血酸0.05 mM）、培养时间（24小时、4、7、12天）、5% CO2、37°C 阅读提示：Materials and methods: Creation of 3D tooth bud constructs |
| 体内植入 | 植入前体外培养4天、动物品系（5月龄雌性Rowett Nude大鼠）、植入部位（皮下背部）、植入时间（3周）、重复数（4个构建体） 阅读提示：Materials and methods: In vivo implantation of biomimetic tooth bud constructs |
| 组织学分析 | 固定（10%福尔马林过夜）、脱钙（22.5%甲酸+10%柠檬酸钠，每3天更换）、石蜡包埋、切片厚度（6 μm） 阅读提示：Materials and methods: Dental Cell sheet 3D tooth bud analyses |
| 免疫组织化学 | 一抗浓度（如DSPP 1:50, OC 1:400, AM 1:500等）、二抗浓度（1:500）、ABC试剂、DAB显色时间（5分钟） 阅读提示：Materials and methods: Dental Cell sheet 3D tooth bud analyses |