建立异种移植小鼠模型
建立LNCaP或PC3单移植和与成纤维细胞重组移植的裸鼠模型，以评估非那雄胺对肿瘤生长的影响。
将LNCaP或PC3细胞，或与成纤维细胞（c-Jun+/+或c-Jun−/−）按1:2.5比例混合，悬浮于PBS和Matrigel中，皮下植入雄性无胸腺裸鼠。肿瘤生长至约100 mm³时，给予非那雄胺（灌胃，100 mg/kg/天）或玉米油（对照）5-6周。
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成纤维细胞和c-Jun在非那雄胺对前列腺癌异种移植模型化学预防和治疗作用中的有趣作用
The intriguing role of fibroblasts and c-Jun in the chemopreventive and therapeutic effect of finasteride on xenograft models of prostate cancer.
实验完整度
高体外共培养、异种移植动物模型、c-Jun敲除功能验证、Western blot机制验证等多种独立证据层级。
主要模型
LNCaP细胞异种移植模型 PC3细胞异种移植模型 LNCaP(PC3)-成纤维细胞重组移植模型 LNCaP(PC3)-c-Jun敲除成纤维细胞重组移植模型
重点核对
细胞系：LNCaP和PC3；成纤维细胞：人原代前列腺成纤维细胞、c-Jun+/+和c-Jun−/−小鼠胚胎成纤维细胞 移植细胞数量：LNCaP 2.5×10^7，PC3 5×10^6，与成纤维细胞按1:2.5比例混合 非那雄胺给药：灌胃，100 mg/kg/天，5-6周 增殖检测：Ki-67免疫组化染色 凋亡检测：TUNEL染色
摘要
在一项大型临床试验中，非那雄胺降低了低级别前列腺癌（PCa）的发病率，同时增加了高级别癌症的发病率。非那雄胺是否促进高级别肿瘤的发展仍存在争议。我们证明了成纤维细胞和c-Jun在非那雄胺对PCa异种移植模型的化学预防和治疗作用中的作用。将LNCaP（PC3）细胞或癌细胞与成纤维细胞的重组体植入接受非那雄胺治疗的雄性无胸腺裸鼠中。评估了肿瘤生长、细胞增殖、凋亡、p-Akt和p-ERK1/2。在LNCaP（PC3）单一移植模型中，非那雄胺未改变肿瘤生长。在重组移植模型中，成纤维细胞和c-Jun促进了肿瘤生长；非那雄胺诱导了LNCaP细胞增殖并抑制了PC3细胞凋亡。当c-Jun被敲除时，成纤维细胞和/或非那雄胺不再促进肿瘤生长。非那雄胺在单一培养的癌细胞中抑制了p-Akt和p-ERK1/2，而在成纤维细胞存在时则刺激了相同的信号分子。在c-Jun−/−成纤维细胞存在时，观察到p-Akt和p-ERK1/2降低。成纤维细胞和c-Jun促进PCa生长；在成纤维细胞和c-Jun存在时，非那雄胺通过促进增殖、抑制凋亡和上调促增殖分子通路进一步刺激肿瘤生长。基质-上皮相互作用在非那雄胺对PCa的治疗效果中起关键作用。我们的发现对使用非那雄胺作为PCa患者的化学预防或治疗药物具有初步意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 非那雄胺是否在成纤维细胞和c-Jun存在下促进前列腺癌的生长和进展？
- 核心机制
- 非那雄胺在成纤维细胞存在时通过上调p-Akt和p-ERK1/2信号通路，促进细胞增殖并抑制细胞凋亡，从而刺激肿瘤生长；c-Jun在成纤维细胞中起关键作用。
- 主要证据
- 在LNCaP和PC3异种移植模型中，成纤维细胞和c-Jun促进肿瘤生长；在成纤维细胞存在时，非那雄胺增加Ki-67阳性细胞比例（LNCaP）并抑制凋亡（PC3）；体外共培养实验显示非那雄胺上调p-Akt和p-ERK1/2。
- 研究意义
- 研究结果提示非那雄胺在特定微环境中可能促进前列腺癌进展，对其作为化学预防或治疗药物具有初步意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估肿瘤生长和增殖凋亡指标
检测非那雄胺和成纤维细胞对肿瘤生长、细胞增殖和凋亡的影响。
测量肿瘤体积和重量；通过Ki-67免疫组化染色评估增殖，通过TUNEL染色评估凋亡。
验证c-Jun在成纤维细胞中的作用
确定c-Jun是否介导成纤维细胞对肿瘤生长的促进作用以及非那雄胺的刺激作用。
比较c-Jun+/+和c-Jun−/−成纤维细胞在重组移植模型中的效果，并检测非那雄胺处理后的肿瘤生长、Ki-67和凋亡变化。
体外共培养研究信号通路
研究非那雄胺在成纤维细胞存在时对癌细胞信号通路的影响。
使用Transwell共培养系统，将LNCaP或PC3细胞与成纤维细胞（或HPF）共培养，用非那雄胺处理，通过Western blot检测p-Akt和p-ERK1/2的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Hyclone | -- | |
| 药物处理 | 非那雄胺 | LKT Laboratories, Inc. | -- |
| 动物实验 | 基质胶 | Becton Dickinson labware | -- |
| 免疫组化 | 抗人Ki-67单克隆抗体 | Maixin Biotech | -- |
| 抗P-CK/Cytokeratin AE1 + AE3抗体 | Bioss | -- | |
| 抗波形蛋白抗体 | Bioss | -- | |
| MaxVision™ HRP-聚合物抗兔免疫组化试剂盒 | Maixin Bio | -- | |
| 凋亡检测 | ApopTag®过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒 | Millipore Corporation | -- |
| Western blot | M-PER哺乳动物蛋白提取试剂 | Pierce Biotechnology | -- |
| Halt蛋白酶抑制剂混合物试剂盒 | Pierce Biotechnology | -- | |
| BCA蛋白测定试剂 | Pierce | -- | |
| Akt抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 磷酸化Akt (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| ERK抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 磷酸化ERK (Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | -- | |
| GAPDH抗体 | Abcam, Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 异种移植模型建立 | 细胞数量、成纤维细胞比例、Matrigel用量、移植部位、小鼠品系、周龄 阅读提示：详见Materials and Methods中的Establishment of the LNCaP (PC3) grafted mouse model |
| 非那雄胺给药 | 给药剂量、给药途径、给药频率、给药时长、对照组处理 阅读提示：详见Materials and Methods中的Establishment of the LNCaP (PC3) grafted mouse model |
| 细胞增殖和凋亡检测 | Ki-67染色条件、TUNEL染色条件、计数细胞数和放大倍数 阅读提示：详见Materials and Methods中的Immunohistochemistry staining of Ki-67, CK, and vimentin和Tunel |
| 体外共培养实验 | 共培养系统、培养基条件、非那雄胺浓度、处理时间 阅读提示：详见Materials and Methods中的Cells and cell culture conditions |
| Western blot检测 | 蛋白提取试剂、抗体来源、稀释比例、内参 阅读提示：详见Materials and Methods中的Cell extracts and Western blot analysis |