检测NEK2在细胞和组织中的表达
评估NEK2在前列腺癌细胞和组织中是否异常表达。
使用定量RT-PCR检测人前列腺癌细胞系和原发前列腺癌组织中NEK2 mRNA表达水平。
Overexpression of NIMA-related kinase 2 is associated with progression and poor prognosis of prostate cancer.
包含体外细胞增殖实验、体内异种移植瘤实验、临床组织样本免疫组化分析及公开数据集验证,缺乏类器官或患者来源异种移植模型等更高层次验证。
人前列腺癌细胞系LNCaP 良性人前列腺上皮细胞系
细胞系:LNCaP siRNA序列及靶序列(NEK2 #1、#2、#3) 转染试剂:Lipofectamine RNAiMAX 细胞接种密度:2×10^3/孔(96孔板) CCK-8检测波长495 nm,孵育4小时
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估NEK2在前列腺癌细胞和组织中是否异常表达。
使用定量RT-PCR检测人前列腺癌细胞系和原发前列腺癌组织中NEK2 mRNA表达水平。
验证NEK2表达下调对前列腺癌细胞增殖的影响。
用靶向NEK2的siRNA转染LNCaP细胞,通过RT-PCR和Western blot验证沉默效率,并进行CCK-8增殖实验。
验证NEK2沉默对LNCaP细胞体内致瘤性的影响。
将NEK2沉默和对照细胞皮下接种于裸鼠两侧,定期测量肿瘤大小,第43天取材。
确定NEK2表达水平是否与前列腺癌患者的临床病理特征和预后相关。
对含有99例PCa和81例癌旁组织的组织微阵列进行免疫组化染色评分,并分析Taylor数据集中的NEK2表达与Gleason评分、病理分期、转移、PSA失败和总生存期的关系。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与处理 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞增殖检测 | CCK-8溶液 | Beyotime | C0038 |
| RNA提取与RT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| cDNA合成 | ReverTra Ace逆转录试剂盒 | TOYOBO | -- |
| 实时PCR | SYBR Green预混液 | TaKaRa | -- |
| 实时PCR检测 | MiniOpticon实时PCR检测系统 | Bio-Rad | -- |
| Western blot | Hybond硝酸纤维素膜 | GE Healthcare | -- |
| 抗NEK2抗体 | Bioss Co Ltd. | bs-5732R | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz | sc-47778 | |
| SuperSignal West PICO化学发光检测试剂盒 | Pierce Biotechnology | -- | |
| 动物实验 | 基质胶 | BD Biosciences | 356234 |
| 免疫组织化学 | DAKO EnVision系统 | Dako Diagnostics | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与增殖实验 | 细胞系:LNCaP;接种密度:2×10^3/孔;检测时间:24、48、72小时;CCK-8孵育时间:4小时;波长:495 nm;重复数:三个独立样本 阅读提示:Methods: Cell culture, transfection, and treatment |
| siRNA转染 | siRNA序列:NEK2 #1、#2、#3及Scr对照;转染试剂:Lipofectamine RNAiMAX;检测时间点:24、48、72小时 阅读提示:Methods: Cell culture, transfection, and treatment; Table 1 |
| 动物实验 | 小鼠品系:裸鼠;年龄:6-8周;细胞数:2×10^6;基质胶比例:1:1;每组小鼠数:5只;实验重复次数:3次;测量时间:第14、23、36天;取材:第43天 阅读提示:Methods: Tumor growth |
| 免疫组化评分 | 组织芯片:99例PCa、81例癌旁组织;抗体稀释度:1:400;评分方法:IRS(百分比评分+强度评分);独立评分人:2位病理学家 阅读提示:Methods: Immunohistochemistry analysis; Results: 图3 |
| 数据统计分析 | 统计软件:SPSS 13.0和SAS 9.1;生存分析:Kaplan-Meier方法;组间比较:对数秩检验;组间差异检验:卡方趋势检验;显著性水平:P < 0.05;分组标准:NEK2表达中位数(高80例,低80例) 阅读提示:Methods: Statistical analysis; Results: 图4 |