Mart基因表达定量分析
测定11个Mart基因在小鼠囊胚和胎盘形成各阶段的mRNA表达水平。
使用绝对定量qPCR，从E4.5囊胚（10和17个混合）和E8.5-E18.5胎盘（n=4-9）提取RNA，用标准曲线计算分子数，18SrRNA归一化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
小鼠胎盘形成过程中sushi-ichi相关反转录转座子衍生家族正义和反义转录本的选择性表达
Selective expression of sense and antisense transcripts of the sushi-ichi-related retrotransposon--derived family during mouse placentogenesis.
实验完整度
高包括qPCR表达定量、ISH定位、TASA-TD正义/反义转录本验证、Northern blot、RACE、免疫印迹等多层级实验，并明确功能验证。
主要模型
小鼠胎盘组织 C57BL/6小鼠 C3H小鼠 小鼠囊胚
重点核对
qPCR使用40 ng cDNA（囊胚4 ng），内参18SrRNA 1 ng ISH使用DIG标记RNA探针，对照无探针 TASA-TD使用GSP-TAG引物，50-400 ng RNA，50℃反转录50分钟 免疫印迹使用15 μg蛋白裂解物，7.5%-12.5% SDS-PAGE Ldoc1/Mart7蛋白归一化GAPDH，用ImageJ定量
摘要
背景：LTR反转录转座子在进化过程中通过获得启动子序列、调控元件和序列修饰而成为功能性新基因。哺乳动物反转录转座子转录本（Mart1-9），也称为sushi-ichi相关反转录转座子同源（SIRH）基因，是一类Ty3/gypsy LTR反转录元件，与河豚中sushi-ichi LTR反转录转座子显示中等同源性。Rtl1/Mart1和Peg10/Mart2在小鼠胎盘中的表达及其在胎盘发育过程中功能作用的证明，突显了它们在细胞过程中的重要性。在这项研究中，我们分析了从囊胚阶段到整个胎盘形成过程中的所有十一个小鼠Mart基因，以获取关于它们表达和调控的信息。结果：定量PCR、原位杂交（ISH）和免疫印迹显示了11个小鼠Mart基因在不同胎盘阶段的多种表达模式。Zcchc5/Mart3、Zcchc16/Mart4和Rgag1/Mart9的表达检测不到。Rtl1/Mart1、Peg10/Mart2、Rgag4/Mart5–Cxx1a,b,c/Mart8b,c,a基因在囊胚阶段的表达非常低。随后的胎盘阶段显示Rtl1/Mart1、Rgag4/Mart5–Cxx1a,b,c/Mart8b,c,a的表达增加，后者在E9.5时高达1,489分子/ng cDNA。根据我们最近发表的发现，Peg10/Mart2是表达最高的Mart基因。ISH显示Rgag4/Mart5到Cxx1a,b,c/Mart8b,c,a的正义和反义转录本在交界区的滋养层亚型中共定位，且反义转录本在细胞核中积累。为了验证这些结果，我们开发了一种TAG辅助的正义/反义转录本检测（TASA-TD）方法，该方法验证了Rtl1/Mart1、Rgag4/Mart5–Cxx1a,b,c/Mart8b,c,a的正义和反义转录本。除Rtl1/Mart1和Cxx1a,b/Mart8b,c外，所有其他Mart基因均显示反义转录本数量减少。Northern blot和5'和3' RACE确认了Ldoc1/Mart7和Cxx1a,b,c/Mart8b,c,a的正义和反义转录本。免疫印迹显示Ldoc1/Mart7在整个胎盘阶段均有一个单一蛋白，但对于Cxx1a,b,c/Mart8b,c,a，在E10.5和E14.5时从57 kDa蛋白转变为E16.5和E18.5时的25 kDa蛋白。结论：小鼠Mart基因的RNA和蛋白质检测支持反转录转座子在哺乳动物基因组中的新功能化。Zcchc5/Mart3、Zcchc16/Mart4和Rgag1/Mart9的不可检测表达表明它们在小鼠胎盘形成中没有作用。Rgag4/Mart5到Cxx1a,b,c/Mart8b,c,a的基因表达支持它们在滋养层分化中的作用。Mart反义转录本和蛋白质改变预测了在小鼠胎盘形成过程中按时定向的独特而复杂的分子调控。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究11个小鼠Mart基因在囊胚阶段及胎盘形成过程中的表达模式、细胞定位及正义/反义转录本的表达，以了解其调控和潜在功能。
- 核心机制
- Mart基因在胎盘形成中表现为新功能化，Rgag4/Mart5至Cxx1a,b,c/Mart8b,c,a在交界区滋养层表达，反义转录本可能参与调控，蛋白质大小转换（Cxx1/Mart8从57 kDa到25 kDa）提示翻译后或加工调控。
- 主要证据
- qPCR显示表达差异，ISH显示Rgag4/Mart5、Ldoc1l/Mart6等正义/反义转录本在交界区pTGC、ST、GlyT中定位，TASA-TD验证正义/反义转录本比例，免疫印迹显示蛋白表达变化。
- 研究意义
- 支持反转录转座子新功能化，表明Mart基因在胎盘发育中的潜在重要作用，并为正义/反义转录本和蛋白调控机制提供证据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Mart基因表达定位分析
确定高表达Mart基因（Rgag4/Mart5、Ldoc1l/Mart6、Ldoc1/Mart7、Cxx1a,b,c/Mart8b,c,a）在胎盘不同滋养层亚型中的细胞定位。
使用DIG标记的正义和反义RNA探针对E8.5、E14.5/E15.5胎盘组织进行原位杂交，同时进行PAS染色鉴定糖原滋养层。
正义/反义转录本验证和定量
验证和定量Mart基因的正义和反义转录本，排除自引发假象。
开发TASA-TD方法，使用TAG标记的基因特异性引物进行第一链cDNA合成，并加入放线菌素D防止第二链合成，然后用TAG引物和基因特异性引物进行PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳并用ImageJ定量。
转录本大小分析
确定Ldoc1/Mart7正义和反义转录本的完整长度。
使用5'和3' RACE方法，从E14.5胎盘RNA扩增转录本末端，产物通过琼脂糖凝胶电泳分析大小。
Cxx1a,b,c/Mart8b,c,a Northern blot分析
确认Cxx1/Mart8基因的正义和反义转录本大小。
从E12.5和E14.5胎盘提取RNA，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，转膜后与DIG标记的正义或反义探针杂交，化学发光检测。
Ldoc1/Mart7和Cxx1a,b,c/Mart8b,c,a蛋白表达分析
检测Ldoc1/Mart7和Cxx1a,b,c/Mart8b,c,a蛋白在胎盘发育过程中的表达变化。
提取E10.5、E14.5、E16.5和E18.5胎盘裂解物，SDS-PAGE分离，转膜后与特异性抗体杂交，化学发光检测，GAPDH归一化，ImageJ定量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因表达定量
蛋白表达分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | peqGOLD TriFast试剂 | PEQLAB Technologies | -- |
| RNA提取（囊胚） | Absolute RNA纳米制备试剂盒 | Agilent | -- |
| cDNA合成（囊胚） | 高容量cDNA试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| qPCR | SYBR绿染料 | Thermo Fisher | -- |
| ABI7300实时PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| ISH探针合成 | RNA标记试剂盒 | Roche | -- |
| PCR | Fast Start Taq聚合酶试剂盒 | Roche | -- |
| Northern blot | ULTRAhyb超灵敏杂交缓冲液 | Ambion/Applied Biosystems | -- |
| Northern blot检测 | AP-Juice化学发光底物 | PJK | -- |
| 5'和3' RACE | 5'/3' RACE试剂盒第二代 | Roche | -- |
| High Pure PCR产物纯化试剂盒 | Roche | -- | |
| Q5高保真DNA聚合酶 | New England Biolabs | -- | |
| poly(A)聚合酶 | New England Biolabs | -- | |
| TASA-TD | SuperScript III第一链合成系统 | Life Technologies | -- |
| RNaseOUT核糖核酸酶抑制剂 | Life Technologies | -- | |
| 免疫印迹 | LDOC1抗体 | Biozol | -- |
| CXX1抗体 | Bioss | -- | |
| GAPDH-HRP抗体 | Santa Cruz | -- | |
| HRP-Juice化学发光底物 | PJK | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠和胎盘制备 | 小鼠品系：C57BL/6和C3H；取材阶段：E8.5-E18.5 阅读提示：Methods - Mice and placenta preparation |
| RNA提取和qPCR | RNA提取：peqGOLD TriFast；囊胚：Absolute RNA Nanoprep Kit；cDNA合成：High Capacity cDNA Kit；qPCR：40 ng cDNA（囊胚4 ng），SYBR-green，ABI7300，18SrRNA归一化 阅读提示：Methods - RNA extraction and cDNA synthesis; Absolute quantitative real time PCR (qPCR) |
| 原位杂交 | 胎盘阶段：E8.5、E14.5/E15.5；DIG标记RNA探针；对照无探针 阅读提示：Methods - In situ hybridization (ISH) |
| TASA-TD | E14.5胎盘RNA；RNA量：50-400 ng；放线菌素D 240 ng；SuperScriptIII RT 100 U；反转录50℃ 50分钟 阅读提示：Methods - First strand cDNA synthesis and strand specific PCR |
| 免疫印迹 | 蛋白量：15 μg；凝胶：7.5%-12.5%梯度；抗体稀释：LDOC1 1:800，CXX1 1:800，GAPDH 1:1000 阅读提示：Methods - Immunoblotting |