细胞因子刺激下ERK激活的磷酸化流式分析
检测野生型与KrasG12D小鼠骨髓细胞中GM-CSF和SCF诱导的ERK磷酸化水平，并评估不同激酶抑制剂的影响
分离骨髓细胞，用指定抑制剂预孵育，再以GM-CSF或SCF刺激，通过磷酸化流式细胞术分析不同细胞亚群（M+G+和K+M−G−）中pERK水平。
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PLC-γ和PI3K将细胞因子信号连接到正常及致癌Kras造血细胞中的ERK激活
PLC-γ and PI3K link cytokines to ERK activation in hematopoietic cells with normal and oncogenic Kras.
实验完整度
高包含体外细胞实验（BMMPCs、原代骨髓细胞）、RNAi敲低、药理学抑制剂、集落形成实验及体内小鼠给药实验，并进行功能与机制验证。
主要模型
野生型小鼠骨髓细胞 Mx1-Cre, KrasG12D小鼠骨髓细胞 骨髓巨噬细胞祖细胞（BMMPCs） KLS 48−造血干/祖细胞富集群体
重点核对
GM-CSF刺激浓度（10 ng/ml或1 ng/ml）及刺激时间（10或15分钟） 抑制剂浓度（5 μM）及预孵育时间（30分钟） 体内GDC-0941给药剂量（100 mg/kg口服）及时间点（2或6小时） BMMPCs培养及血清饥饿条件（4小时或过夜） CFU-GM集落形成实验中甲基纤维素培养基及GM-CSF浓度（10 ng/ml）
摘要
致癌性K-Ras蛋白，如K-RasG12D，会积累在活性的三磷酸鸟苷（GTP）结合构象中，并通过效应激酶刺激信号传导。在原发性造血细胞中，当K-RasG12D癌蛋白的丰度与内源性野生型K-Ras相似时，仅导致经典的Raf–丝裂原活化或细胞外信号调节蛋白激酶激酶（MEK）–细胞外信号调节激酶（ERK）和磷酸肌醇-3激酶（PI3K）–Akt–哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号级联的最低程度磷酸化和激活，这些通路仍然依赖生长因子才能有效激活。在此，我们证明磷脂酶Cγ（PLC-γ）、PI3K及其产生的第二信使将激活的细胞因子受体连接到分化的骨髓细胞和高度富集白血病干细胞的细胞群中的Ras和ERK信号传导。表达内源性致癌K-RasG12D的细胞仍依赖第二信使二酰甘油来有效激活Ras-ERK信号传导。这些数据提出了一个意想不到的可能性，即在癌症中治疗性靶向致癌Ras上游起作用的蛋白质。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在正常和致癌K-RasG12D造血细胞中，细胞因子（如GM-CSF和SCF）如何通过PLC-γ和PI3K激活Ras-ERK信号通路？
- 核心机制
- PLC-γ和PI3K在细胞因子受体激活后生成第二信使DAG和PIP3，这些信使将信号传递至Ras和Raf-MEK-ERK级联，且PLC-γ位于PI3K上游。
- 主要证据
- 通过磷酸化流式细胞术、Western blotting、RNAi敲低和药理学抑制剂实验，在野生型与KrasG12D骨髓细胞及BMMPCs中证明抑制PLC-γ或PI3K可阻断GM-CSF/SCF诱导的ERK磷酸化，且DAG类似物PMA可绕过此抑制。
- 研究意义
- 研究提示靶向致癌Ras上游蛋白（如PLC-γ和PI3K）可能成为治疗生长因子高度响应的癌症（如JMML和CMML）的可行策略，并警告PI3K抑制剂可能导致正常造血干祖细胞中细胞因子信号受抑的骨髓抑制副作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Ras-GTP和下游信号蛋白的生化检测
确定PLC-γ和PI3K在Ras-Raf-MEK-ERK信号通路中的作用位置
在抑制剂存在下，用GM-CSF刺激骨髓细胞或BMMPCs，通过Raf-RBD pulldown实验检测Ras-GTP水平，并通过Western blotting检测pERK和pAkt水平。
BMMPCs中PLC-γ和PI3K的功能研究
利用RNAi敲低和药理学抑制剂，探究PLC-γ和PI3K在GM-CSF激活ERK和Akt中的功能关系
在BMMPCs中通过逆转录病毒转导shRNA敲低PLC-γ1或PLC-γ2，或使用U73122和PI-90，观察GM-CSF刺激后ERK和Akt磷酸化水平。
DAG类似物PMA对信号通路的激活
验证DAG能否绕过PLC-γ和PI3K抑制，直接激活Ras-ERK通路
用PMA或GM-CSF处理BMMPCs，检测Ras-GTP、pERK和pAkt水平，并观察抑制剂存在下PMA对ERK磷酸化的影响。
造血祖细胞集落形成实验（CFU-GM）
评估PLC-γ和PI3K对髓系祖细胞功能的影响
在含有GM-CSF的甲基纤维素培养基中，加入不同浓度的JakI、PI-90、U73122或Akt VIII，计数CFU-GM集落形成。
体内PI3K抑制剂处理对骨髓细胞ERK激活的影响
验证PI3K抑制剂在体内是否抑制细胞因子诱导的骨髓细胞ERK激活
给小鼠口服GDC-0941或PD0325901，在不同时间点处死小鼠，分离骨髓细胞并用GM-CSF刺激后检测pERK水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | pERK抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 |
| RasGRP3抗体 | Cell Signaling Technology | 3334 | |
| β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| pAkt抗体 | Invitrogen | 44-621G | |
| Ras抗体（克隆Ras10） | Millipore | 05-516 | |
| RasGRP4抗体 | Covalab | pab0554-1 | |
| PLC-γ1抗体 | Santa Cruz | sc-7290 | |
| PLC-γ2抗体 | Bioss | bs-3532R | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | DakoCytomation | P0448 | |
| 辣根过氧化物酶标记的绵羊抗小鼠IgG | GE Healthcare | NA931V | |
| FITC标记的抗兔IgG | Jackson Immunoresearch | 711-096-152 | |
| APC标记的抗兔IgG | Jackson Immunoresearch | 711-136-152 | |
| pSTAT5（pY694）抗体 | BD Biosciences | 612599 | |
| pPLC-γ1抗体 | Bioss | bs-3343R | |
| pPLC-γ2抗体 | Bioss | bs-3339R | |
| CD11b/Mac1抗体 | BD Pharmingen | 553311 | |
| Gr1抗体 | BD Pharmingen | 553128 | |
| CD117/c-kit抗体 | eBioscience | 15-1171-320 | |
| CD16/CD32抗体 | BD Biosciences | 553142 | |
| 抑制剂 | JakI | Calbiochem | 420099 |
| SU6656 | Calbiochem | 572635 | |
| PP2 | Calbiochem | 529576 | |
| 双吲哚马来酰亚胺I（BIM I） | Calbiochem | 203291 | |
| U73122 | Calbiochem | 662035 | |
| U73343 | Calbiochem | 662041 | |
| 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| 2-氨基乙基二苯基硼酸酯 | Sigma-Aldrich | D9754 | |
| KN-62 | Sigma-Aldrich | I2142 | |
| PD0325901 | Pfizer Inc. | -- | |
| GDC-0941 | Genentech, Inc. | -- | |
| PLX4720 | Plexxikon, Inc. | -- | |
| PI-90 | -- | -- | |
| PI-103 | -- | -- | |
| AS605240 | -- | -- | |
| TGX 115 | -- | -- | |
| IC87114 | -- | -- | |
| SW13 | -- | -- | |
| 试剂 | Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 |
| RasGRP3 siRNA | Invitrogen | MSS216067 | |
| RasGRP4 siRNA | Invitrogen | MSS239172 | |
| 阴性通用对照低GC | Invitrogen | 12935-110 | |
| 细胞培养 | Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM） | -- | -- |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | -- | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | -- | |
| 干细胞因子 | Peprotech | -- | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | -- | |
| 甲基纤维素培养基M3231 | Stem Cell Technologies | -- | |
| PBS基解离缓冲液 | Gibco | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | -- |
| Immobilon-P膜 | Millipore | -- | |
| 增强化学发光试剂 | Amersham Biosciences | -- | |
| ECL plus | GE Healthcare | -- | |
| qPCR | RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| Nanodrop分光光度计 | -- | -- | |
| Taqman 7300 | Applied Biosystems | -- | |
| Amplitaq Gold混合液 | Applied Biosystems | -- | |
| Taqman探针 | Applied Biosystems | Mm01205647_g1, Mm01233143_m1, Mm00460898_m1 | |
| 动物实验 | 聚肌胞苷酸 | Sigma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞刺激与抑制剂处理 | GM-CSF浓度（10或1 ng/ml）、SCF浓度（100 ng/ml）、刺激时间（10或15分钟）、抑制剂种类及浓度（5 μM）、预孵育时间（30分钟） 阅读提示：Materials and Methods: Harvesting and stimulation of bone marrow cells; Figure legends 1A-C |
| BMMPCs的培养与处理 | 巨噬细胞培养基成分、M-CSF浓度（30 ng/ml）、血清饥饿时间（4小时或过夜）、细胞传代次数 阅读提示：Materials and Methods: Culture and stimulation of BMMPCs |
| Ras-GTP检测 | 细胞裂解缓冲液成分、Raf-RBD pulldown实验步骤 阅读提示：Materials and Methods: Western blotting analysis and Ras-GTP assays |
| 体内药物处理 | GDC-0941剂量（100 mg/kg口服）、PD0325901剂量（5 mg/kg口服）、给药后处理时间（2或6小时）、小鼠品系及数量（n=3） 阅读提示：Results: In vivo treatment of mice with a PI3K inhibitor; Figure 5 legend |
| CFU-GM集落形成实验 | 甲基纤维素培养基（M3231）、GM-CSF浓度（10 ng/ml）、抑制剂浓度（0.1-10 μM）、培养时间（8天） 阅读提示：Materials and Methods: Flow cytometric analysis and myeloid progenitor cell proliferation; Figure 2D legend |