免疫沉淀条件优化
开发并优化从骨骼肌中分离DAPC的免疫沉淀方法。
使用MANDAG2抗体（针对β-dystroglycan胞内域）与Dynabeads Protein G偶联，从去污剂裂解的骨骼肌中免疫沉淀dystroglycan及其结合蛋白。测试不同去污剂条件，最终采用1%洋地黄皂苷和0.05% NP-40。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
野生型、mdx和Galgt2转基因小鼠骨骼肌中dystroglycan相关蛋白的比较蛋白质组学分析
Comparative proteomic profiling of dystroglycan-associated proteins in wild type, mdx, and Galgt2 transgenic mouse skeletal muscle.
实验完整度
中包含免疫沉淀、质谱蛋白质组学、免疫共沉淀、免疫染色等验证，但缺乏功能验证实验。
主要模型
C57Bl/6野生型小鼠骨骼肌 mdx（C57Bl/10ScSn-Dmdmdx/J）小鼠骨骼肌 Galgt2转基因野生型和mdx小鼠骨骼肌 P3ProCreDag1loxP/loxP小鼠后肢骨骼肌（dystroglycan缺失）
重点核对
免疫沉淀抗体：抗β-dystroglycan单克隆抗体MANDAG2，对照抗体MW8 肌肉样品：100 mg股四头肌和腓肠肌 裂解缓冲液：含1%洋地黄皂苷和0.05% NP-40 质谱分析：LTQ质谱仪，SEQUEST数据库搜索 FDR阈值：<5%（除一个样本外）
摘要
Dystroglycan是骨骼肌中主要的细胞表面糖蛋白受体，与细胞外基质结合。dystroglycan糖基化缺陷会导致肌营养不良，dystroglycan糖基化的改变会影响细胞外基质结合。本文描述了一种免疫沉淀技术，可从去污剂溶解的骨骼肌中分离β-dystroglycan及其与肌营养不良蛋白相关蛋白复合体（DAPC）的成员。免疫沉淀结合鸟枪法蛋白质组学，使我们能够鉴定新的dystroglycan相关蛋白，并确定营养不良骨骼肌中DAPC内发生的关联变化。此外，我们还描述了Galgt2过表达引起的变化，Galgt2是一种通常在突触表达的肌肉糖基转移酶，可修饰α-dystroglycan，并在过表达时抑制肌营养不良的发展。这些研究鉴定了新的dystroglycan相关蛋白，它们可能参与dystroglycan在肌营养不良中的正负作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过比较蛋白质组学鉴定dystroglycan相关蛋白，并定义在mdx和Galgt2转基因肌肉中DAPC组成的变化？
- 核心机制
- Galgt2过表达改变α-dystroglycan糖基化，可能促进dystroglycan与Spire2和IL15Rα等蛋白的相互作用，从而稳定DAPC并抑制肌营养不良。（基于免疫共沉淀和共定位，文献未明确因果机制）
- 主要证据
- 免疫沉淀结合LC-MS/MS鉴定已知DAPC成员，发现Galgt2转基因肌肉中Spire2和IL15Rα与β-dystroglycan共沉淀和共定位（图2、图3）。
- 研究意义
- 提供了一种高效的方法来鉴定新的dystroglycan相关蛋白和DAPC变化，可能有助于理解肌营养不良的病理机制和治疗干预。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鸟枪法蛋白质组学鉴定
鉴定dystroglycan免疫沉淀复合物中的蛋白质，并比较不同基因型肌肉中DAPC组成。
对免疫沉淀的蛋白进行胶上胰蛋白酶消化，肽段经nano-LC-MS/MS分析，使用SEQUEST数据库搜索，并减去对照IP中的非特异性蛋白。
共定位和共沉淀验证
验证新鉴定的候选蛋白（Spire2和IL15Rα）与dystroglycan的关联。
对野生型、Galgt2转基因、mdx和Dag1-/-肌肉进行免疫荧光共定位和免疫共沉淀实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫沉淀 | Dynabeads Protein G磁珠 | Invitrogen | -- |
| Protein G 琼脂糖 | Invitrogen | -- | |
| MANDAG2抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | -- | |
| MW8抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | -- | |
| cOmplete ULTRA蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | -- | |
| 高效液相色谱 | C18色谱柱（Zorbax SB，5 μm） | Agilent | -- |
| 质谱分析 | LTQ质谱仪 | Thermo Finnigan | -- |
| 纳升电喷雾离子源 | -- | -- | |
| 安捷伦1100自动进样器 | Agilent | -- | |
| 蛋白质消化 | 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 免疫印迹 | 硝酸纤维素膜 | -- | -- |
| 免疫沉淀 | 二甲基庚二亚胺酯 | -- | -- |
| Dynabead-Protein G-MANDAG2复合物 | Invitrogen | -- | |
| Dynabead-Protein G-MW8复合物 | Invitrogen | -- | |
| 抗IL15Rα抗体（bs-2605R） | Bioss | -- | |
| 抗Spire2抗体（17757-1-AP） | Proteintech | -- | |
| 免疫印迹 | 抗β-dystroglycan抗体（43DAG或MANDAG2） | Novo Castra/DSHB | -- |
| 抗dystrophin抗体（Dys1或MANEX1011b） | Novo Castra/DSHB | -- | |
| 抗utrophin抗体 | DSHB | -- | |
| 抗α-dystroglycan抗体（克隆IIH6C4） | Upstate Biotechnology | -- | |
| 抗α-dystrobrevin抗体（610766） | BD Bioscience | -- | |
| 抗α-和β-syntrophins抗体 | kind gift of Dr. Stanley Froehner | -- | |
| 抗白细胞介素15受体α抗体 | Bioss/R&D systems | -- | |
| 抗Spire2抗体 | Abgent/Proteintech | -- | |
| 抗αB晶状体蛋白抗体 | Enzo Life Sciences | -- | |
| 抗突触足蛋白2抗体 | Prosci | -- | |
| 抗菱形相关蛋白1抗体 | Abcam | -- | |
| 免疫荧光 | Cy2/Cy3标记二抗 | Jackson Immunoresearch | -- |
| 马血清 | -- | -- | |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 十二烷基硫酸钠 | -- | -- | |
| 质谱分析 | 甲酸 | -- | -- |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| 碳酸氢铵 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与肌肉取材 | 小鼠品系、性别、年龄、饲养条件、肌肉类型（股四头肌和腓肠肌）和样本量。 阅读提示：实验步骤中‘Animals’部分 |
| 免疫沉淀 | 裂解缓冲液成分（洋地黄皂苷浓度、NP-40浓度）、抗体（MANDAG2和MW8）浓度、Protein G磁珠用量、交联剂DMP浓度、孵育时间和温度。 阅读提示：实验步骤中‘Sample Preparation and Immunoprecipitation’部分 |
| 质谱分析 | 色谱柱规格、流动相梯度、质谱参数（如碰撞能量、动态排除）、数据库版本和搜索参数（如肽段容差、FDR阈值）。 阅读提示：实验步骤中‘Nano-LC-ESI-MS/MS and data analysis’部分 |
| 免疫共沉淀验证 | 用于共沉淀的抗体（抗IL15Rα和抗Spire2）及浓度、蛋白G琼脂糖用量、Western blot检测的抗体。 阅读提示：实验步骤中‘Sample Preparation and Immunoprecipitation’和‘Western Blotting’部分，以及图3图注 |
| 免疫荧光共定位 | 肌肉切片厚度、固定液（2%多聚甲醛）、抗原修复条件（0.2% SDS）、封闭液、一抗和二抗浓度、孵育时间。 阅读提示：实验步骤中‘Immunostaining and Confocal Microscopy’部分及图2图注 |