细胞分离与培养
获取主动脉瓣膜内皮细胞和间质细胞
从新鲜猪心脏中提取主动脉瓣，分别用胶原酶II和分散酶消化分离VECs，用多步消化法（胶原酶II、透明质酸酶、胶原酶III）分离VICs，并分别培养在相应培养基中。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
利用磁悬浮技术建立主动脉瓣三维共培养模型
A three-dimensional co-culture model of the aortic valve using magnetic levitation.
实验完整度
中包含细胞分离、共培养组装、免疫组化、qRT-PCR和代谢检测，但缺乏功能验证和机制验证。
主要模型
猪主动脉瓣膜内皮细胞（VECs） 猪主动脉瓣膜间质细胞（VICs） 主动脉瓣共培养模型（AVCC）
重点核对
细胞来源：新鲜猪心脏，主动脉瓣提取 共培养组装：磁悬浮法，顺序组装VECs和VICs 培养时间：3天 培养基：VEC培养基（含2% FBS） 培养条件：37°C，5% CO2，95%湿度
摘要
主动脉瓣由瓣膜间质细胞（VICs）和瓣膜内皮细胞（VECs）组成。虽然已知这些细胞协同维持瓣叶结构和瓣膜功能，但关于这些细胞类型的共培养模型很少。在本研究中，利用磁悬浮技术组装了主动脉瓣共培养物（AVCCs），并培养3天。采用免疫组织化学和qRT-PCR评估细胞表型和功能的维持以及细胞外基质的形成。AVCCs对CD31和α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）染色阳性，表明表型得以维持。功能性标志物内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、血管性血友病因子（VWF）和脯氨酰-4-羟化酶存在。细胞外基质成分I型胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白也染色阳性，与2D相比，这些蛋白在3D中的基因表达降低。AVCCs中I型胶原、赖氨酰氧化酶和αSMA的基因表达低于2D培养物，表明VICs处于静止状态。AVCC中CD31和αSMA的共定位提示可能发生内皮-间质转分化（EnMT）。2D和3D培养的VECs中VWF和eNOS的差异也提示AVCC可能具有抗血栓潜力。总之，设计了一种主动脉瓣共培养模型，为未来研究心脏瓣膜生物学奠定了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用磁悬浮技术构建主动脉瓣共培养模型，并验证其细胞表型、功能和细胞外基质形成？
- 核心机制
- 文中未明确说明
- 主要证据
- 免疫组化显示AVCC中αSMA和CD31阳性，功能标志物eNOS、VWF、P4H等存在，ECM成分Col I、FN、Lam阳性；qRT-PCR显示αSMA、COL1A1、FN等表达在3D中较2D降低，提示VICs静止
- 研究意义
- 该模型可作为未来研究心脏瓣膜生物学，如力学生物学和钙化性主动脉瓣疾病进展的基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
磁悬浮3D培养
利用磁纳米颗粒组装3D单培养物和共培养物
将细胞与NanoShuttle孵育过夜，胰酶消化后重悬于低吸附24孔板，用磁驱动器将细胞悬浮至空气-液体界面形成3D结构。共培养时先分别组装VECs和VICs的3D培养物，再用聚四氟乙烯笔顺序拾取组装。
细胞代谢检测
评估NanoShuttle和磁场对细胞代谢的影响
使用MTT法检测细胞代谢活性，在8天内多个时间点测量。
免疫组织化学分析
验证共培养物中细胞表型、功能和ECM形成
对AVCC切片和2D培养细胞进行免疫荧光染色，检测表型标志物（αSMA、CD31）、功能标志物（eNOS、VWF、P4H）、ECM成分（Col I、FN、Lam）和细胞连接蛋白（VE-cad、N-cad）。
基因表达分析
定量比较共培养物与2D培养物中相关基因的表达
提取RNA，反转录为cDNA，使用qRT-PCR检测表型、功能和ECM相关基因的表达，以GAPDH为内参，归一化至AVCC。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | EGM-2培养基 | Lonza Biosciences | -- |
| DMEM/F12培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 牛生长血清 | Hyclone | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| HEPES缓冲液 | -- | -- | |
| 明胶 | -- | -- | |
| 细胞分离 | 胶原酶II | -- | -- |
| 分散酶 | -- | -- | |
| 透明质酸酶 | -- | -- | |
| 胶原酶III | -- | -- | |
| 细胞分选 | 小鼠单克隆抗CD31抗体 | Millipore | -- |
| 磁悬浮 | Bio-Assembler试剂盒 | Nano3D Biosciences | -- |
| NanoShuttle | Nano3D Biosciences | -- | |
| 钕磁铁 | -- | -- | |
| 代谢检测 | MTT试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 噻唑蓝四氮唑溴盐 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 异丙醇 | -- | -- | |
| 免疫组化 | 抗原修复液 | Biocare Medical | -- |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 驴血清 | GeneTex | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| AlexaFluor 488 | Invitrogen | -- | |
| AlexaFluor 633 | Invitrogen | -- | |
| DAPI | KPL | -- | |
| 抗α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Abcam | -- | |
| 抗CD31抗体 | Abcam | -- | |
| 抗I型胶原抗体 | Abcam | -- | |
| 抗层粘连蛋白抗体 | Abcam | -- | |
| 抗纤连蛋白抗体 | Abcam | -- | |
| 抗脯氨酰4-羟化酶抗体 | Bioss | -- | |
| 抗eNOS抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 抗VWF抗体 | Abcam | -- | |
| 抗VE-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗N-钙黏蛋白抗体 | Invitrogen | -- | |
| 分子生物学 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| QuantiTect SYBR Green PCR预混液 | Clontech Laboratories | -- | |
| Mastercycler ep realplex实时荧光定量PCR仪 | Eppendorf | -- | |
| 免疫组化 | LSM 510 META NLO共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞分离与培养 | 细胞来源（新鲜猪心脏）、分离酶浓度、培养基组成、培养条件（37°C，5% CO2，95%湿度） 阅读提示：Materials and Methods 2.1 Cell Isolation and Culture |
| 磁悬浮3D培养 | NanoShuttle浓度（8 μL/cm² 或 50 μL/mL）、细胞数量（500,000 cells/3D culture）、共培养顺序（先VECs后VICs）、共培养时间（3天）、培养基（VEC培养基） 阅读提示：Materials and Methods 2.2 Magnetic Levitation 和 2.4 Co-Culture Assembly |
| 细胞代谢检测 | 细胞接种密度（25,000 cells/well）、MTT浓度（0.5 mg/mL）、测量时间点（第2、4、6、8天）、样本量（n=9） 阅读提示：Materials and Methods 2.3 Cell Metabolism |
| 免疫组织化学分析 | 固定时间（至少5小时）、抗原修复条件（80°C，30分钟）、一抗稀释（制造商推荐）、二抗类型（AlexaFluor 488/633）、封片剂（DAPI） 阅读提示：Materials and Methods 2.5 Immunohistochemistry |
| 基因表达分析 | 内参基因（GAPDH）、样本量（n=3-5）、cDNA合成试剂盒（Primescript 1st strand cDNA Synthesis Kit） 阅读提示：Materials and Methods 2.6 Quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction |