靶点预测与网络构建
筛选芒柄花素治疗肌少症的潜在靶点并构建药物-靶点-疾病网络。
利用TCMSP、SwissTargetPrediction预测药物靶点，从CTD、OMIM、GeneCards获取疾病靶点，取交集得到81个共同靶点，并用Cytoscape构建网络。
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芒柄花素抗肌少症作用的网络药理学分析和体外验证
Network pharmacology analysis and in vitro verification of the anti-sarcopenia effects of formononetin.
实验完整度
中包含网络药理学、分子对接、分子动力学模拟及细胞实验等多层级验证，但缺乏体内动物模型或临床样本验证。
主要模型
C2C12小鼠成肌细胞 地塞米松诱导的C2C12肌管萎缩模型 网络药理学靶点预测模型
重点核对
细胞模型：C2C12小鼠成肌细胞系 地塞米松（DEX）处理浓度：250 μM，处理时间：4小时 芒柄花素（FMN）处理浓度：75 μM，处理时间：24小时 样本量：细胞活力检测n=6，基因和蛋白表达检测n=3 对照设置：对照组（vehicle-only）与模型组（DEX）
摘要
与功能障碍相关的肌少症（SP）非常普遍；然而，针对该疾病的治疗策略仍然有限。炎症和氧化应激是关键因素。正因如此，芒柄花素（FMN）具有多种益处，包括抗氧化、抗凋亡和抗炎特性。因此，本研究利用网络药理学确定了FMN缓解SP的81个潜在靶基因。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、表皮生长因子受体（EGFR）和去乙酰化酶1（SIRT1）为核心靶点。京都基因与基因组百科全书分析表明，FMN主要通过白细胞介素（IL）-17、PI3K-Akt和FoxO信号通路影响SP。细胞研究表明，FMN可减少IL-6释放并提高超氧化物歧化酶活性，从而增强C2C12骨骼肌细胞活力。FMN干预还增强了AKT1和SIRT1基因和蛋白质的表达，降低肌肉特异性环指蛋白-1基因表达，并增加EGFR蛋白表达。这表明其在地塞米松处理的C2C12细胞中具有抗炎和抗氧化作用，可能通过抑制蛋白质分解来预防肌肉萎缩。这些发现突显了FMN在治疗SP中具有前景的多靶点作用和分子机制，并提示未来的临床应用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 芒柄花素是否通过抗炎和抗氧化机制缓解肌少症？
- 核心机制
- 芒柄花素通过激活AKT1和SIRT1，抑制MuRF1表达，并可能通过PI3K/Akt/mTOR信号通路，减轻炎症（降低IL-6）和氧化应激（增强SOD活性），从而缓解肌肉萎缩。
- 主要证据
- 网络药理学和分子对接预测核心靶点，分子动力学模拟验证FMN与SIRT1稳定结合；体外实验显示FMN降低DEX诱导的C2C12细胞IL-6水平，升高SOD活性，增强细胞活力，并调节AKT1、SIRT1、EGFR及MuRF1的表达。
- 研究意义
- 研究提示芒柄花素作为多靶点天然化合物有望用于肌少症的治疗或膳食补充。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PPI网络与核心靶点筛选
通过蛋白互作网络分析确定核心靶点。
使用STRING数据库构建PPI网络，并通过CytoNCA进行拓扑分析，根据DC、BC、CC值筛选核心靶点。
GO和KEGG富集分析
探究富集的生物学过程和信号通路。
结合GEO差异表达基因和交集靶点，使用DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析，并可视化结果。
分子对接与动力学模拟
验证FMN与核心靶点的结合亲和力及稳定性。
使用AutoDock Vina进行分子对接，并用Gromacs进行100ns的分子动力学模拟，分析RMSD、Rg、SASA和氢键。
细胞活力测定
确定DEX和FMN的最佳处理浓度。
使用CCK-8试剂盒检测不同浓度DEX和FMN处理下C2C12肌管细胞活力，并确定后续实验浓度。
形态学分析
观察DEX诱导的肌管萎缩及FMN的缓解作用。
使用倒置显微镜观察C2C12肌管细胞在DEX和FMN处理下的形态变化。
炎症和氧化应激指标检测
评估FMN对DEX诱导的炎症和氧化应激的影响。
使用ELISA检测IL-6含量，使用SOD试剂盒检测SOD活性。
基因和蛋白表达分析
检测FMN对相关基因和蛋白表达的影响。
使用RT-qPCR检测SIRT1、AKT1、MuRF1基因表达，使用Western blot检测AKT1、SIRT1、EGFR蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Hongquan | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%） | Solarbio | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Solarbio | -- | |
| 二甲基亚砜 | Solarbio | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | Solarbio | -- | |
| 药物处理 | 芒柄花素 | Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 地塞米松 | Beyotime | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Signalway Antibody | -- |
| 炎症和氧化应激指标检测 | 白细胞介素-6 ELISA试剂盒 | Beyotime | -- |
| 超氧化物歧化酶检测试剂盒 | Beyotime | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| SYBR Green PCR试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 逆转录试剂盒 | Fermentas | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白上样缓冲液 | Solarbio | -- | |
| AKT1抗体 | Beyotime | -- | |
| SIRT1抗体 | Beyotime | -- | |
| EGFR抗体 | Beyotime | -- | |
| HRP标记二抗 | Beyotime | -- | |
| GAPDH抗体 | Beyotime | -- | |
| 分子对接 | AutoDock Vina | -- | -- |
| 分子动力学模拟 | Gromacs | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | C2C12细胞培养条件：DMEM+10% FBS，37°C，5% CO2；分化培养基DMEM+2%马血清，处理6天，隔天换液 阅读提示：见Materials and methods中Cell culture部分 |
| 细胞活力检测 | 细胞接种密度：1×10^4 cells/well；FMN处理浓度：0-100 μM，24h；DEX处理浓度：0-1000 μM，4h；CCK-8孵育时间：90min；检测波长：450nm 阅读提示：见Materials and methods中Cell viability determination部分及Figure 7图注 |
| 形态学分析 | 细胞密度：1×10^5 cells/well；FMN处理：75 μM，24h；DEX处理：250 μM，4h；观察区域：随机3个；放大倍数：200× 阅读提示：见Materials and methods中Morphological analysis部分 |
| 药物处理分组 | 分组：对照组（无血清培养基），DEX组（250 μM DEX），DEX+FMN组（250 μM DEX + 75 μM FMN）；处理时间：24h 阅读提示：见Materials and methods中Treatment of DEX and FMN部分 |
| 炎症和氧化应激指标检测 | SOD检测：样品量20 μL，加200 μL水溶性四唑盐工作液和20 μL酶溶液，37°C孵育20min，450nm测定；IL-6检测：按照ELISA试剂盒说明 阅读提示：见Materials and methods中Detection of SOD activity and IL-6 content部分 |
| RT-qPCR | 反应体系：11 μL双蒸水，10 μL SYBR Green Mix，1 μL正向引物，1 μL反向引物，2 μL cDNA模板（总25 μL）；反应条件：95°C 1min初变性，40循环（95°C 15s，60°C 15s）；内参：GAPDH 阅读提示：见Materials and methods中Real-time PCR assays部分和Table 1 |
| Western blot | 蛋白上样量：40 μg；一抗稀释：AKT1 1:1000, SIRT1 1:1000, EGFR 1:1000；二抗稀释：1:1000；封闭液：5%脱脂牛奶含0.1% Tween20 阅读提示：见Materials and methods中Western blotting analysis部分 |