OSI耐药细胞模型建立与验证
构建并验证对奥希替尼耐药的NSCLC细胞模型，为后续实验提供基础。
将H1975和HCC827亲本细胞暴露于梯度递增浓度的奥希替尼（0.2-10 μM），经过约6个月筛选建立耐药细胞系；通过MTT、克隆形成、迁移实验及EMT标志物检测验证耐药特征。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
一种新型双胍衍生物通过BMI1促进NEDD4介导的FGFR1泛素化以克服非小细胞肺癌中奥希替尼耐药
A novel biguanide-derivative promotes NEDD4-mediated FGFR1 ubiquitination through BMI1 to overcome osimertinib resistance in NSCLC.
实验完整度
高包含体外细胞模型、体内移植瘤模型和临床样本分析等多个独立证据层级，并明确机制验证。
主要模型
H1975P/H1975R细胞系 HCC827P/HCC827R细胞系 H1975R细胞异种移植瘤模型 NSCLC患者组织样本
重点核对
OSI耐药细胞系建立方法（梯度递增OSI浓度，约6个月） SMK-010剂量（2 μM用于体外，6 mg/kg/天腹腔注射用于体内） OSI剂量（2 μM用于体外，5 mg/kg/天口服灌胃用于体内） BMI1和FGFR1在临床样本中的表达与OSI耐药相关性
摘要
目的：奥希替尼（OSI）治疗作为治疗非小细胞肺癌（NSCLC）的基石，已受到快速发展获得的耐药性的严重限制。使用联合策略抑制旁路激活有望克服这种耐药性。双胍类药物具有优异的抗肿瘤效果，近期因其这种潜力而备受关注。本研究调查了本团队开发的新型双胍化合物是否能克服OSI耐药，并探讨了其潜在机制。方法：使用OSI耐药细胞进行综合筛选，确定了双胍化合物与OSI的最佳组合。采用蛋白质组学、免疫共沉淀质谱、RNA测序和同源重组实验来阐明联合治疗的分子机制。从本临床获取的NSCLC肿瘤组织，特别是OSI耐药组织，用于评估关键蛋白与OSI耐药之间的相关性。结果：SMK-010，一种高效的双胍化合物，在体外和体内有效克服了OSI耐药。机制研究表明，BMI1/FGFR1通路激活是OSI耐药的原因。具体来说，沉默BMI1促进了NEDD4介导的FGFR1泛素化和蛋白酶体降解，而SMK-010处理诱导FGFR1溶酶体降解。FGFR1水平的降低损害了同源重组，增加了DNA损伤，并克服了OSI耐药。临床样本分析显示，BMI1和FGFR1在NSCLC组织中过表达，并代表了OSI耐药的潜在生物标志物。结论：这些发现强调了BMI1/FGFR1轴在OSI耐药中的关键作用，并为未来双胍类药物SMK-010与OSI联合的临床应用提供了合理依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 新型双胍衍生物能否通过调节BMI1/FGFR1轴克服非小细胞肺癌对奥希替尼的获得性耐药，及其潜在的分子机制。
- 核心机制
- BMI1稳定FGFR1蛋白，通过抑制NEDD4介导的泛素化和蛋白酶体降解；奥希替尼诱导BMI1和FGFR1表达增加及核转位，促进同源重组，导致耐药。SMK-010抑制BMI1，促进FGFR1溶酶体降解，从而抑制同源重组，增加DNA损伤，逆转耐药。
- 主要证据
- 体外实验显示SMK-010与OSI协同抑制耐药细胞增殖、克隆形成和迁移；体内实验显示联合治疗显著抑制移植瘤生长；RNA-seq和功能实验表明BMI1/FGFR1敲低抑制同源重组；临床样本中BMI1和FGFR1高表达与OSI耐药相关。
- 研究意义
- 本研究首次建立BMI1与NSCLC中OSI耐药的联系，为SMK-010与OSI联合治疗克服耐药提供理论基础，并为BMI1和FGFR1作为耐药生物标志物提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选与OSI协同的双胍衍生物
从多个双胍衍生物中筛选出与奥希替尼协同效果最佳的化合物。
在H1975R细胞中，将10种双胍衍生物与OSI(2 μM)联合处理，通过MTT检测细胞活力，计算联合指数（CI），确定最佳组合。
验证SMK-010体外克服耐药效果
验证SMK-010与奥希替尼联合对耐药细胞增殖、克隆形成和迁移的影响。
使用H1975R和HCC827R细胞，进行克隆形成和Transwell迁移实验，比较OSI单药与联合SMK-010的效果。
蛋白质组学筛选与FGFR1验证
鉴定SMK-010处理后的差异表达蛋白，并验证FGFR1作为关键靶点。
对H1975R细胞进行SMK-010处理（6 μM，24小时），进行无标记定量蛋白质组学，鉴定差异蛋白；通过Western blot验证FGFR1蛋白水平下降，并检查下游AKT和ERK1/2磷酸化水平。
澄清BMI1与FGFR1的调控关系
确定BMI1对FGFR1的调控方式及NEDD4在其中的作用。
通过siRNA敲低BMI1或FGFR1，检测蛋白和mRNA水平；利用放线菌酮跟踪蛋白半衰期；使用MG132和CQ区分蛋白酶体和溶酶体降解途径；siRNA敲低NEDD4或CBL检测对FGFR1降解的影响；Co-IP检测FGFR1泛素化水平。
验证BMI1和FGFR1抑制对OSI敏感性的影响
检测敲低BMI1或FGFR1以及药理学抑制剂对耐药细胞对奥希替尼敏感性的影响。
使用siRNA敲低BMI1或FGFR1，或使用抑制剂PTC-209（BMI1抑制剂）和PD173074（FGFR1抑制剂），进行MTT细胞增殖实验和克隆形成实验，评估对OSI敏感性的影响并计算联合指数。
分析SMK-010对BMI1和FGFR1降解的影响
阐明SMK-010如何抑制BMI1并促进FGFR1降解。
通过Western blot检测BMI1水平；RT-qPCR检测FGFR1 mRNA水平；利用CHX追踪蛋白半衰期；使用CQ和MG132确定降解途径；siRNA敲低NEDD4或CBL检测FGFR1降解变化；Co-IP检测泛素化水平。
考察SMK-010联合OSI对同源重组和DNA损伤的影响
验证联合治疗是否抑制同源重组并增加DNA损伤。
进行RNA-seq分析敲低BMI1或FGFR1后差异基因及富集通路；RT-qPCR验证HR相关基因表达；使用同源重组报告质粒（pDRGFP和pCBASce-I）检测HR活性；通过免疫荧光检测p-H2AX表达。
体内评估联合治疗的抗肿瘤效果
评估SMK-010联合奥希替尼在体内对OSI耐药肿瘤的抑制作用及安全性。
使用H1975R异种移植瘤模型，将荷瘤小鼠随机分组，每日分别给予载体、OSI、SMK-010和联合治疗，测量肿瘤体积和体重；通过HE染色及ALT/AST检测评估毒性；Western blot检测肿瘤组织中FGFR1和BMI1表达。
临床样本中BMI1和FGFR1表达与预后的关联
评估BMI1和FGFR1在NSCLC患者组织中的表达及其与奥希替尼耐药和预后的关系。
收集NSCLC手术样本（21例），通过免疫组化检测BMI1和FGFR1表达；在配对样本（16例）比较耐药前后表达变化；使用Kaplan-Meier Plotter数据库分析表达与总生存期的关联。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证蛋白相互作用
分析蛋白泛素化
分析转录组数据
分析蛋白组数据
验证DNA损伤修复
验证体内效果
分析临床样本
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞活性检测 | 甲基噻唑基四唑（MTT） | -- | -- |
| 药物处理 | PTC-209 | Selleck Chemicals | -- |
| PD173074 | Selleck Chemicals | -- | |
| 奥希替尼 | Selleck Chemicals | -- | |
| 蛋白质检测 | PVDF膜 | -- | -- |
| 转染 | Lipofectamine 6,000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 蛋白降解研究 | MG132 | -- | -- |
| 氯喹 | -- | -- | |
| 免疫沉淀 | Protein A/G磁珠 | Santa Cruz | -- |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | Beyotime | -- |
| 同源重组检测 | pDRGFP质粒 | AddGene | -- |
| pCBASce-I质粒 | AddGene | -- | |
| 动物实验 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| BALB/c裸鼠 | Hunan Slack Jingda Experimental Animal Company | -- | |
| 细胞增殖 | CompuSyn软件 | CompuSyn, Inc. | -- |
| 数据处理 | SPSS软件 | IBM | -- |
| GraphPad Prism 9.0软件 | GraphPad, Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 培养基成分（RPMI-1640、10% FBS），培养条件（37°C、5% CO2），细胞系来源 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and reagents |
| MTT实验 | 细胞接种密度、药物处理时间、MTT浓度、测量波长（550 nm） 阅读提示：Materials and methods: Cell viability assay; Figure 1 legend |
| 克隆形成实验 | 细胞接种密度（2×10^3细胞/孔） 阅读提示：Materials and methods: Clonogenic growth assay; Figure 1 legend |
| Transwell迁移实验 | 细胞接种数（4×10^4细胞）、上室体积（200 μL）、下室培养基体积（700 μL）、孵育时间（24小时） 阅读提示：Materials and methods: Transwell assay; Figure 1 legend |
| Western blot | 蛋白提取量、抗体信息（Table S2）、显影系统 阅读提示：Materials and methods: Western blotting |
| 蛋白质降解分析 | 放线菌酮浓度、MG132和CQ浓度（文中未明确说明） 阅读提示：Materials and methods: Western blotting; Results sections |
| RNA-seq | RNA质量、文库构建试剂盒、测序平台（G400/T7/T10）、分析软件 阅读提示：Materials and methods: RNA-seq |
| IP-MS | 蛋白量（1000 μg）、抗体（anti-BMI1、anti-FGFR1）、质谱仪（Q Exactive） 阅读提示：Materials and methods: Immunoprecipitation, IP-MS |
| 体内实验 | 动物品系（BALB/c裸鼠）、细胞注射量（0.2 mL Matrigel）、给药剂量（OSI 5 mg/kg；SMK-010 6 mg/kg）、给药方式（口服/腹腔）、频次（每日）、治疗周期（第14-29天） 阅读提示：Materials and methods: Cell line-derived xenograft models; Figure 7 legend |
| 临床样本分析 | 样本来源、伦理审批、IHC评分标准 阅读提示：Materials and methods: Immunohistochemistry; Figure 8 legend |