SalA体外抑制PRRSV复制
评估SalA对PRRSV复制的影响
MARC-145细胞和PAMs感染PRRSV后，用不同浓度SalA处理，检测病毒蛋白表达、mRNA水平和上清病毒滴度。
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丹酚酸A通过结合Keap1激活MKRN1-Nrf2-NQO1通路抑制PRRSV复制
Salvianolic acid A inhibits PRRSV replication via binding to Keap1 to activate the MKRN1-Nrf2-NQO1 pathway.
实验完整度
高包含体外细胞模型、动物模型和转录组分析等多个证据层级，并结合分子机制验证（CETSA、DARTS、pull-down、泛素化分析等），功能验证充分。
主要模型
MARC-145细胞 猪肺泡巨噬细胞（PAMs） 猪只模型（HP-PRRSV JXA1株感染） HEK293T细胞（机制研究）
重点核对
SalA浓度（0-20 μM）及处理时间（36 hpi） PRRSV毒株（GD-HD、SD16、VR2332、NADC30-Like、JXA1）及MOI MKRN1、Nrf2、NQO1的敲低或过表达 Keap1突变体（T560R、K615R等） 体内实验给药剂量（5或10 mg/kg）及给药方式（肌肉注射）
摘要
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）给全球养猪业造成了重大经济损失，目前尚无安全、有效且可商业化的疫苗。中药可作为疫苗的有益补充，为防控PRRS提供可行的解决方案。本研究探讨了中药丹参提取物丹酚酸A（SalA）对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）复制的作用及分子机制。SalA在体外和体内均能有效抑制PRRSV复制，且不影响病毒复制周期的吸附、进入或释放阶段。SalA通过氢键直接结合Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）的Thr560位点，促进Keap1招募新发现的E3泛素连接酶makorin RING finger蛋白1（MKRN1）。这导致Keap1在K615氨基酸残基处发生K48连接的多聚泛素化，随后经蛋白酶体降解，最终激活核因子E2相关因子2（Nrf2）-NADPH醌氧化还原酶1（NQO1）通路。敲低MKRN1阻断了SalA诱导的Keap1泛素化、降解以及Nrf2-NQO1通路的激活。进一步的病毒感染实验表明，SalA通过激活MKRN1-Nrf2-NQO1通路抑制PRRSV复制。除了抗PRRSV活性外，SalA还通过激活Nrf2通路有效抑制PRRSV和脂多糖（LPS）诱导的炎性细胞因子表达、炎性通路和炎性小体的激活，以及细胞焦亡的抑制。这些结果表明，SalA可以抑制PRRSV复制并减轻PRRS及继发性细菌感染期间的炎症反应，为PRRS治疗提供了一种新的候选策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SalA对PRRSV复制的作用及其潜在分子机制是什么？
- 核心机制
- SalA直接结合Keap1的Thr560位点，促进Keap1招募E3泛素连接酶MKRN1，导致Keap1在K615位点发生K48连接的多聚泛素化并降解，从而激活Nrf2-NQO1通路，最终抑制PRRSV复制和炎症反应。
- 主要证据
- 体外实验显示SalA剂量依赖地抑制PRRSV复制（降低N和Nsp4蛋白表达及病毒滴度）；体内实验显示SalA治疗显著减轻猪只肺部病变和病毒载量；机制实验通过CETSA、DARTS、pull-down、Co-IP、泛素化分析等证明了SalA与Keap1结合并促进其降解，且激活Nrf2-NQO1通路，过表达或敲低MKRN1、Nrf2、NQO1均影响SalA的抗病毒效果。
- 研究意义
- SalA可能作为一种新的候选策略用于PRRS治疗，其通过激活Keap1-Nrf2通路发挥抗病毒和抗炎活性，为抗PRRSV药物开发提供了新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SalA体内抑制PRRSV复制
评估SalA在猪体内的抗病毒效果
猪只感染HP-PRRSV JXA1株后，用SalA治疗，观察临床症状、存活率、肺部病变和病毒载量。
转录组分析揭示SalA作用通路
筛选SalA处理细胞后的差异表达基因和相关信号通路
MARC-145细胞用20 μM SalA或DMSO处理24小时，进行RNA-seq，分析DEGs、GO和KEGG富集。
验证Nrf2-NQO1通路激活
验证SalA是否激活Nrf2-NQO1通路
检测Keap1、Nrf2、NQO1的mRNA和蛋白表达，以及Nrf2的核转位。
阐明SalA促进Keap1降解的机制
确定Keap1降解途径及具体分子机制
使用蛋白酶体抑制剂MG-132、自噬抑制剂3-MA、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK处理，检测Keap1蛋白水平；检测泛素化类型；预测并验证泛素化位点。
鉴定Keap1的E3泛素连接酶
寻找SalA诱导Keap1泛素化的E3连接酶
利用UbiBrowser预测潜在E3连接酶，过表达IRF2BP1、MKRN1、MKRN3，检测对Keap1泛素化的影响，验证MKRN1与Keap1的相互作用。
验证SalA与Keap1的直接结合
确认SalA直接结合Keap1并确定结合位点
通过CETSA、DARTS、pull-down实验检测直接结合，分子对接和MDS预测结合位点，并通过突变体验证。
验证MKRN1/Nrf2/NQO1通路在SalA抗病毒中的作用
确证SalA抑制PRRSV复制依赖于该通路
过表达或敲低MKRN1、Nrf2、NQO1，检测对PRRSV复制的影响，并评估敲低对SalA抑制作用的影响。
评估SalA对PRRSV和LPS诱导炎症及焦亡的影响
研究SalA的抗炎和抗焦亡作用及Nrf2在其中作用
PRRSV或LPS处理PAMs，检测炎性细胞因子、炎症通路蛋白和焦亡相关蛋白，并敲低Nrf2观察SalA效应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 丹酚酸A | MedChemExpress | HY-N0318 |
| MG-132蛋白酶体抑制剂 | MedChemExpress | HY-13259 | |
| Z-VAD-FMK (caspase-1抑制剂) | MedChemExpress | HY-16658B | |
| 3-甲基腺嘌呤 | MedChemExpress | HY-19312 | |
| 蛋白处理 | 蛋白酶 | MedChemExpress | -- |
| 细胞裂解 | NP-40裂解液 | Beyotime Biotechnology | P0013F |
| 药物处理 | 二甲基亚砜 | Solarbio | D8371 |
| 脂多糖 | Solarbio | L8880 | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | Solarbio | P8230 |
| Western blot | 抗Myc标签抗体 | Beyotime Biotechnology | AF2865 |
| 抗HA标签抗体 | Beyotime Biotechnology | AF2858 | |
| 抗p-ERK抗体 | Beyotime Biotechnology | AF5818 | |
| 抗p-P65抗体 | Beyotime Biotechnology | AF5875 | |
| 抗P65抗体 | Beyotime Biotechnology | AF1234 | |
| 抗p-IκBα抗体 | Beyotime Biotechnology | AF5851 | |
| 抗IκBα抗体 | Beyotime Biotechnology | AF5204 | |
| 抗JNK抗体 | Beyotime Biotechnology | AF1048 | |
| 抗P38抗体 | Beyotime Biotechnology | AF7668 | |
| 抗p-P38抗体 | Beyotime Biotechnology | AF5887 | |
| 抗TLR4抗体 | Beyotime Biotechnology | AF8187 | |
| 抗MyD88抗体 | Beyotime Biotechnology | AF7524 | |
| 抗Txnip抗体 | Beyotime Biotechnology | AF8277 | |
| 抗NLRP3抗体 | Beyotime Biotechnology | AF2155 | |
| 抗p-JNK抗体 | Beyotime Biotechnology | K006234 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Proteintech Group | 11224-1-AP | |
| 抗Nrf2抗体 | Proteintech Group | 16396-1-AP | |
| 抗Keap1抗体 | Proteintech Group | 10503-2-AP | |
| 抗IL-1β抗体 | Proteintech Group | 16,806–1-AP | |
| 抗ASC抗体 | Proteintech Group | 10500-1-AP | |
| 抗caspase-1抗体 | Proteintech Group | 22915-1-AP | |
| 抗GSDMD抗体 | Abcam | ab210070 | |
| 抗NQO1抗体 | Signalway Antibody | 49364-1 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H&L） | Signalway Antibody | -- | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG（H&L） | Signalway Antibody | -- | |
| 抗PRRSV N蛋白抗体 | 实验室自制 | -- | |
| 抗PRRSV Nsp4蛋白抗体 | 实验室自制 | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| qRT-PCR | Novoscript® Plus 一步法第一链cDNA合成SuperMix | -- | -- |
| SYBR Green (未明确提及，但qRT-PCR通常使用) | -- | -- | |
| Western blot | 蛋白G磁珠 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 增强化学发光试剂 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG（H&L） | -- | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| Pull-down | 链霉亲和素包被的磁珠 | -- | -- |
| 生物素 | -- | -- | |
| CETSA | NP-40裂解液 | Beyotime Biotechnology | P0013F |
| CCK-8 | CCK-8试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C0038 |
| 酶标仪 | 自动酶标仪 | BioTek | -- |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| Western blot | Amersham Imager 600成像仪 | Cytiva | -- |
| 图像采集 | Zeiss LSM 510共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞活力检测 | MARC-145细胞或PAMs接种密度、SalA浓度梯度、处理时间、CCK-8孵育时间 阅读提示：见Materials and methods 'Cell viability and antiviral activity assay' |
| 体外抗病毒实验 | PRRSV毒株、MOI、SalA浓度、处理起始时间（1 hpi）、收获时间（36 hpi）、检测指标 阅读提示：见Materials and methods 'Cell treatment' 和Figure 1 图注 |
| 病毒吸附/内化/释放实验 | MOI (10)、SalA浓度、温度（4°C和37°C）、处理时间（1小时） 阅读提示：见Materials and methods 'Cell treatment' 和Figure 1 N–P |
| 动物实验 | 猪龄、分组、攻毒剂量（105 TCID50）、SalA剂量（5和10 mg/kg）、给药方式（肌肉注射）、给药时间（6 hpi起，连续3天）、观察时间（14天）、检测指标 阅读提示：见Materials and methods 'Animal experiments' 和Figure 2 |
| 转录组测序 | SalA浓度（20 μM）、处理时间（24小时）、生物学重复数（3个） 阅读提示：见Materials and methods 'RNA sequencing and bioinformatics analysis of transcriptomes' |
| Nrf2通路验证 | SalA浓度梯度、处理时间（24小时）、细胞类型（MARC-145、PAMs）、检测mRNA和蛋白的方法 阅读提示：见Materials and methods 'Quantitative real-time PCR' 和 'Co-immunoprecipitation and western blotting analysis' |
| Keap1降解机制 | 抑制剂浓度（MG-132 2 μM、3-MA 5 mM、Z-VAD-FMK 50 μM）、处理时间（24小时）、泛素化分析转染质粒及抗体 阅读提示：见Materials and methods 'Cell treatment' 和Figure 4 图注 |
| E3连接酶鉴定 | 质粒转染（Flag-MKRN1等）、siMKRN1序列及转染条件、Co-IP条件 阅读提示：见Materials and methods 'Co-immunoprecipitation and western blotting analysis' 和Figure 5 |
| 直接结合验证 | CETSA温度梯度、DARTS pronase浓度（1 μg/mL）、bio-SalA浓度、pull-down条件 阅读提示：见Materials and methods 'Cellular thermal shift assay (CETSA)', 'Drug affinity responsive target stability (DARTS)' 和 'Small molecule–protein interaction pull-down assay' |
| 通路功能验证 | 敲低或过表达MKRN1、Nrf2、NQO1的质粒或siRNA序列、感染MOI、时间点（24/36/48 hpi） 阅读提示：见Materials and methods 'Cells and viruses' 和Figure 7 图注 |
| 炎症与焦亡评估 | PRRSV或LPS浓度、处理时间（24 h）、SalA浓度、检测细胞因子及蛋白 阅读提示：见Materials and methods 'Cell treatment' 和Figure 8/9 图注 |