转录组筛选与ER-phagy鉴定
鉴定apelin-13诱导的自噬类型和关键受体蛋白
对apelin-13处理的HUVECs进行RNA-seq分析，检测自噬相关基因和ER-phagy受体蛋白转录水平；使用TEM观察ER-phagy形态。
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SEC62依赖性内质网自噬在apelin-13/APJ诱导的单核细胞-血管内皮细胞黏附及动脉粥样硬化发病机制中的作用
SEC62-dependent ER-phagy contributes to apelin-13/APJ-induced monocyte-vascular endothelial cell adhesion in atherosclerosis pathogenesis.
实验完整度
高包含体外细胞实验（HUVECs、THP-1）、转录组分析、蛋白表达检测、内质网自噬形态观察、体内小鼠模型（APOE−/−小鼠）及人动脉粥样硬化样本免疫组化，涵盖功能验证与机制验证。
主要模型
人脐静脉内皮细胞（HUVECs） THP-1单核细胞系 APOE−/−小鼠动脉粥样硬化模型 人动脉粥样硬化动脉样本
重点核对
Apelin-13处理浓度（0.001–1 μM）和时间（24 h） SEC62敲低（siRNA-SEC62）或内皮特异性敲除（CRISPR-Cas9） 自噬抑制剂3MA（10 mM）和内质网应激抑制剂salubrinal（10 μM）处理 ALDH1L1 812位赖氨酸突变（ALDH1L1Mut812K） 小鼠分组及给药方案：Apelin-13（5 mg·kg−1·d−1）和F13A（5 mg·kg−1·d−1）腹腔注射，持续12周
摘要
单核细胞黏附于血管内皮细胞是动脉粥样硬化发病机制中的关键步骤。我们此前发现ROS-自噬通路参与了血管紧张素结构域1型受体相关蛋白（APJ）及其内源性配体apelin-13诱导的单核细胞-内皮细胞黏附。在本研究中，我们探讨了apelin-13在此过程中调节的自噬的具体类型。通过对apelin-13处理的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行全规模转录组分析，我们发现内质网自噬受体蛋白SEC62的转录水平显著升高。重要的是，SEC62在人动脉粥样硬化病变中也上调。因此，我们研究了SEC62依赖性内质网自噬对apelin-13诱导的单核细胞-内皮细胞黏附和动脉粥样硬化发病机制的影响。我们证明，Apelin-13（0.001–1 μM）剂量依赖性地上调SEC62表达，从而诱导HUVECs中的内质网自噬。自噬抑制剂3MA（10 mM）和内质网应激抑制剂salubrinal（10 μM）可逆转此效应。siRNA-Sec62、3MA（10 mM）和salubrinal（10 μM）均抑制了apelin-13诱导的单核细胞-内皮细胞黏附，而血管内皮细胞特异性SEC62缺失减轻了高脂高胆固醇饮食的apelin-13处理的APOE−/−小鼠的动脉粥样硬化斑块面积、细胞间黏附分子表达和病变内巨噬细胞。此外，我们证明ALDH1L1的泛素样修饰参与了apelin-13处理的HUVECs中SEC62依赖性内质网自噬：apelin-13上调小泛素样蛋白UBL4A，其介导ALDH1L1在812-赖氨酸位点的泛素化样修饰。这反过来促进了ALDH1L1插入内质网膜，并导致SEC62依赖性内质网自噬。我们表明，siRNA-UBL4A、siRNA-ALDH1L1、siRNA-ASNA1和ALDH1L1的812赖氨酸位点突变体均减少了apelin-13诱导的单核细胞-内皮细胞黏附。我们得出结论，apelin-13诱导SEC62依赖性内质网自噬，以促进单核细胞-内皮细胞黏附和动脉粥样硬化。本研究揭示了动脉粥样硬化的新机制，并确定了一个潜在的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- apelin-13/APJ诱导的单核细胞-血管内皮细胞黏附是否涉及特定类型的选择性自噬，以及其分子机制和与动脉粥样硬化的关系。
- 核心机制
- apelin-13上调UBL4A，介导ALDH1L1在812-赖氨酸位点的泛素化样修饰，促进ALDH1L1插入内质网膜，触发SEC62依赖性内质网自噬，进而促进单核细胞-内皮细胞黏附和动脉粥样硬化。
- 主要证据
- RNA-seq显示SEC62转录升高；Western blot和免疫荧光证实apelin-13诱导SEC62表达及与LC3共定位；siRNA-SEC62、3MA、salubrinal抑制黏附；内皮特异性SEC62敲除减轻APOE−/−小鼠动脉粥样硬化斑块；siRNA-UBL4A、siRNA-ALDH1L1、siRNA-ASNA1和ALDH1L1Mut812K减少黏附。
- 研究意义
- 作者提出SEC62依赖性内质网自噬可能是动脉粥样硬化的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SEC62表达及ER-phagy验证
验证apelin-13对SEC62表达和ER-phagy的诱导作用及其依赖性
Western blot检测SEC62、LC3 II/I、Bip、Beclin1表达；免疫荧光检测SEC62与LC3共定位；使用APJ抑制剂F13A、自噬抑制剂3MA、ER应激抑制剂salubrinal处理。
人动脉粥样硬化样本SEC62表达检测
评估SEC62在人类动脉粥样硬化中的表达水平
对正常和动脉粥样硬化患者动脉样本进行免疫组化检测SEC62。
SEC62功能缺失体外实验
验证SEC62在apelin-13诱导的单核细胞-内皮细胞黏附中的作用
HUVECs转染siRNA-SEC62，检测ICAM1、VCAM1表达和THP-1细胞黏附。
体内动脉粥样硬化模型验证
验证内皮细胞SEC62在动脉粥样硬化发展中的作用
APOE−/−小鼠高脂饮食，分为对照组、apelin-13组和apelin-13+F13A组；建立内皮特异性SEC62敲除小鼠，检测斑块面积、胶原沉积、巨噬细胞和黏附分子表达。
ALDH1L1及其泛素样修饰在ER-phagy中的作用
探讨ALDH1L1是否参与SEC62依赖性ER-phagy及其修饰方式
检测apelin-13对ALDH1L1表达和定位的影响；敲低ALDH1L1或突变812赖氨酸位点，检测SEC62、LC3等表达和ER-phagy形态。
UBL4A和ASNA1在ER-phagy和黏附中的作用
阐明UBL4A和ASNA1在ALDH1L1修饰和ER-phagy中的作用
检测apelin-13对UBL4A和ASNA1表达的影响；敲低UBL4A或ASNA1，检测ALDH1L1、SEC62、LC3等表达和ER-phagy形态。
ALDH1L1修饰对单核细胞黏附的功能验证
验证ALDH1L1泛素样修饰及UBL4A/ASNA1在黏附中的功能
检测ALDH1L1敲低或突变、UBL4A或ASNA1敲低对ICAM1、VCAM1表达和THP-1黏附的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | BasalMedia | -- |
| RPMI-1640培养基 | BasalMedia | -- | |
| 胎牛血清 | HAKATA | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | BasalMedia | -- | |
| 药物处理 | Apelin-13 | QYAOBIO | -- |
| F13A | QYAOBIO | -- | |
| 内质网应激抑制 | Salubrinal | -- | -- |
| 自噬抑制 | 3-甲基腺嘌呤 | -- | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Solarbio | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Vazyme | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| SEC62抗体 | Signalway | 57144-2 | |
| LC3抗体 | Cell Signaling Technology | 2775S | |
| BIP抗体 | Abcam | ab21685 | |
| CHOP抗体 | Cell Signaling Technology | 5554 | |
| Beclin1抗体 | Proteintech | 11306-1-AP | |
| ICAM1抗体 | Proteintech | 10831-1-AP | |
| VCAM1抗体 | Proteintech | 11444-1-AP | |
| ALDH1L1抗体 | Proteintech | 17390-1-AP | |
| UBL4A抗体 | Proteintech | 14253-1-AP | |
| ASNA1抗体 | Proteintech | 15450-1-AP | |
| ECL Plus试剂盒 | -- | -- | |
| Tanon Imager 6200成像仪 | Tanon | -- | |
| 细胞黏附实验 | 钙黄绿素-乙酰氧基甲酯 | Invitrogen | C3099 |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| 免疫组化 | 柠檬酸盐缓冲液 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | ZSGB-BIO | -- | |
| 二抗 | ZSGB-BIO | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo | -- |
| 慢病毒包装 | LV5-EF1α-GFP+PURO慢病毒载体 | GenePharma | T66120-2 |
| 动物实验 | CRISPR-Cas9腺病毒 | Vector Builder | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HUVECs和THP-1细胞系来源、培养基成分（DMEM/RPMI-1640, 10% FBS, 1%双抗）、培养环境（5% CO2, 37°C） 阅读提示：Materials and Methods, Cell culture |
| 药物处理 | Apelin-13浓度（0.001–1 μM）和处理时间（24 h）；F13A处理浓度 阅读提示：Figure 1 legend, Figure 2 legend, Materials and Methods |
| 抑制实验 | 自噬抑制剂3MA浓度（10 mM）和处理时间；内质网应激抑制剂salubrinal浓度（10 μM）和处理时间 阅读提示：Figure 1 legend, Materials and Methods |
| 基因敲低 | siRNA序列（SEC62, ALDH1L1, UBL4A, ASNA1）、转染试剂（Lipofectamine 3000）、转染时间（24–48 h） 阅读提示：Materials and Methods, Cell transfection of small interfering RNA (siRNA), Table 1 |
| 动物模型 | 小鼠品系（APOE−/−, C57BL/6, 8周龄, 雄性）、高脂饮食成分和持续时间（12周）、给药方案（apelin-13和F13A剂量5 mg·kg−1·d−1腹腔注射）、样本量（n=6/组） 阅读提示：Materials and Methods, Animals |
| 内皮特异性SEC62敲除 | CRISPR-Cas9腺病毒载体、注射剂量（3×10^11颗粒）、注射方式（尾静脉） 阅读提示：Materials and Methods, CRISPR-mediated sec62-vascular endothelial cells specifically KO model |
| 蛋白检测 | 抗体信息（SEC62, LC3, BIP, CHOP, Beclin1, ICAM1, VCAM1, ALDH1L1, UBL4A, ASNA1）、蛋白上样量（40 µg）、SDS-PAGE浓度（10%–12%） 阅读提示：Materials and Methods, Western blot analysis |