验证MSX1相分离特性
确认MSX1是否能在体内外发生相分离并形成具有动态液体性质的凝聚体。
在HEK293T、HEPM和MEPM细胞中观察内源和外源MSX1的凝聚体形成；使用1,6-己二醇处理、FRAP实验、时间序列成像检测凝聚体的动态性；体外纯化MSX1蛋白进行液滴形成、浊度、FRAP和融合实验。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
PRMT1甲基化的MSX1通过相分离调控腭发育
PRMT1-methylated MSX1 phase separates to control palate development.
实验完整度
高包含体外纯化蛋白相分离实验、细胞实验（HEK293T、HEPM、MEPM）以及体内斑马鱼和小鼠模型验证，并进行了功能验证（细胞增殖）和机制验证（甲基化位点及信号通路）。
主要模型
HEK293T细胞 人胚胎腭间充质细胞（HEPM） 小鼠胚胎腭间充质细胞（MEPM） Tg(sox10:egfp)斑马鱼胚胎 C57BL/6J小鼠胚胎
重点核对
MSX1 IDR内R150和R157的甲基化状态 PRMT1的活性或表达水平 MSX1相分离凝聚体的动态性（FRAP恢复时间） 胚胎腭间充质细胞的增殖能力（PCNA阳性细胞数、细胞周期分析） 斑马鱼和小鼠模型中的腭裂表型
摘要
关于相分离在颅面发育障碍中的调控和功能知之甚少。MSX1突变与人类腭裂相关，腭裂是最常见的颅面出生缺陷。在这里，我们展示了MSX1相分离是胚胎腭融合背后的一个脊椎动物保守机制。值得注意的是，MSX1相分离由其 intrinsically disordered protein region (IDR) 触发，并由PRMT1催化的甲基化调控，特别是MSX1 IDR中精氨酸的不对称二甲基化，包括R150和R157。由于甲基化位点突变和PRMT1缺乏导致的低甲基化MSX1持续导致异常的MSX1相分离，形成动态性较差的凝胶状凝聚体，导致胚胎腭间充质细胞增殖缺陷和腭裂。此外，在人类腭裂患者中已鉴定出MSX1 IDR的高频突变，特别是R157S。总的来说，我们揭示了MSX1相分离作为腭裂背后保守机制的功能和调控通路，提供了一个与颅面发育障碍相关的表型相关相分离机制的概念验证示例。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MSX1是否通过相分离机制调控腭发育，以及PRMT1介导的甲基化如何调控该过程并与腭裂相关。
- 核心机制
- MSX1通过其N端IDR发生相分离，PRMT1直接结合并二甲基化IDR中的R150和R157，甲基化减弱了MSX1的相分离倾向，维持其动态液滴状凝聚体；甲基化缺陷导致MSX1形成动态性较差的凝胶状凝聚体，抑制胚胎腭间充质细胞增殖，进而导致腭裂。
- 主要证据
- 体外纯化蛋白相分离实验显示MSX1形成液滴，FRAP显示动态恢复；R150S/R157S突变或PRMT1抑制导致凝胶状凝聚体形成，细胞增殖能力下降；斑马鱼prmt1 MO和msx1 MO模型以及小鼠腺病毒敲低模型均表现出腭裂表型，且MSX1-FL可部分挽救，而R150S/R157S突变体效果不佳。
- 研究意义
- 本研究提供了颅面发育障碍作为相分离相关疾病的概念验证示例，为未来通过直接调控相分离进行预防性治疗和创新治疗方法提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定IDR在MSX1相分离中的作用
验证MSX1的N端IDR是否是相分离所必需的。
构建MSX1截短突变体（ΔIDR、IDR等），在细胞和体外检测相分离能力。
验证PRMT1对MSX1的甲基化调控
确认PRMT1是否直接结合并甲基化MSX1，以及该甲基化修饰是否影响MSX1相分离。
通过免疫共沉淀、pull-down、免疫荧光共定位验证PRMT1与MSX1的相互作用；使用MS023抑制剂、siRNA敲低、体外甲基化实验检测MSX1的aDMA水平；分析甲基化对MSX1相分离动态性的影响。
鉴定MSX1甲基化位点并验证其功能
确定PRMT1在MSX1上的具体甲基化位点，并验证这些位点的甲基化对MSX1相分离和细胞功能的影响。
通过预测和质谱数据鉴定R150和R157；构建R150S、R157S、R150K、R157K、R150F、R157F突变体，检测其甲基化水平、相分离特性和对HEPM细胞增殖的影响。
在斑马鱼模型中验证体内功能
评估PRMT1和MSX1在斑马鱼腭发育中的功能，并验证MSX1相分离的异常是否导致腭裂。
利用Tg(sox10:egfp)斑马鱼，通过吗啉代寡核苷酸敲低prmt1或msx1，或注射MSX1 mRNA（FL或突变体），观察腭发育、细胞增殖和MSX1相分离状态。
在小鼠模型中验证体内功能
在哺乳动物模型中验证PRMT1和MSX1在腭发育中的作用。
通过腺病毒介导的shRNA敲低孕鼠体内PRMT1或MSX1，或共注射MSX1-FL/R150S/R157S腺病毒，观察胚胎腭裂表型和细胞增殖情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Gibco | C11330500BT |
| α-MEM培养基 | Gibco | C12440500BT | |
| 高糖DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT | |
| 胎牛血清 | Vivacell | C04001-500 | |
| 青霉素-链霉素 | Beyotime | C0222 | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.05%) | Thermo Fisher | 25300062 | |
| MS023 | MCE | HY-19615 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma | BCCD8942 | |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668019 |
| Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher | 31985070 | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| Protein A+G磁珠 | Beyotime | P2108 | |
| 免疫沉淀 | MSX1抗体 | Santa Cruz | sc-517256 |
| GFP抗体 | Abbkine | ABT2020 | |
| FLAG抗体 | Abbkine | ABT2010 | |
| 免疫印迹 | 不对称二甲基精氨酸抗体 | Cell Signaling | 13522S |
| 对称二甲基精氨酸抗体 | SAB | 30384 | |
| PRMT1抗体 | Santa Cruz | sc-166963 | |
| GAPDH抗体 | Bioworld | AP0063 | |
| 免疫荧光 | DAPI | Beyotime | C1005 |
| 斑马鱼实验 | MS222 | -- | -- |
| 蛋白酶K | Sigma | 39450-01-6 | |
| 阿尔辛蓝 | Sigma | A5268 | |
| PHH3抗体 | Santa Cruz | A2971 | |
| GFP抗体 | Santa Cruz | sc-9996 | |
| Alexa Fluor cy3抗兔二抗 | Beyotime | A0516 | |
| Alexa Fluor 488抗鼠二抗 | Beyotime | A0428 | |
| PCR | RNA提取试剂盒 | Vazyme | RC101-01 |
| HiScript III逆转录预混液 | Vazyme | R323-01 | |
| ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q341-02 | |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA琼脂糖 | QIAGEN | 163026181 |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL凝胶过滤柱 | -- | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Vazyme | E112-01 | |
| 体外甲基化 | S-腺苷甲硫氨酸 | Yeason | 10619ES02 |
| 体外相分离 | 3C蛋白酶 | Beyotime | P2302 |
| 细胞周期 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 荧光素酶报告 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| 质粒构建 | FastPure质粒小提试剂盒 | Vazyme | DC201 |
| DH5α感受态细胞 | TIANGEN | CB101 | |
| 蛋白表达 | BL21 (DE3)-Rosetta感受态细胞 | TIANGEN | CB108 |
| 卡那霉素 | Sangon Biotech | A600286 | |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | Yeason | 10902ES08 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系来源、培养基类型、血清浓度、MS023处理浓度（30 nM）和时间（24小时） 阅读提示：Methods中的Cells culture部分 |
| 质粒构建与转染 | 质粒构建方法、转染试剂（Lipofectamine 2000）及用量配比（1 μg核酸:1 μL转染试剂） 阅读提示：Methods中的Plasmids construction和Transfection部分 |
| PRMT1敲低 | siRNA序列、转染条件、敲低效率验证 阅读提示：Methods中的Transfection部分及补充表2 |
| 体外相分离实验 | 蛋白纯化方法、蛋白浓度（0-40 μM）、NaCl浓度（0-200 mM）、缓冲液成分（150 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT）、3C蛋白酶切割条件 阅读提示：Methods中的Recombinant protein expression and purification和MSX1 droplet assay部分 |
| 斑马鱼实验 | 斑马鱼品系、MO序列和剂量（2 ng/胚胎）、mRNA注射剂量（50 pg/胚胎）、观察时间点（72 hpf, 96 hpf, 120 hpf） 阅读提示：Methods中的Morpholinos and mRNA microinjection和Fluorescence microscopy for zebrafish部分 |
| 小鼠实验 | 小鼠品系（C57BL/6J）、注射时间（E10.5）、腺病毒剂量（2×10^9 PFU）、shRNA序列 阅读提示：Methods中的Adenovirus production and injection部分 |
| 细胞增殖检测 | 细胞周期检测方法（流式细胞术）、增殖标记基因（PCNA, CCND1等）的qPCR引物和条件、PCNA免疫荧光染色条件 阅读提示：Methods中的Cell cycle和Immunostaining and microscopy for mice and cells部分 |