患者队列建立与样本收集
建立用于发现和验证LNM预测模型的T1期CRC患者队列。
收集了221例T1期CRC患者的FFPE肿瘤样本，分为训练队列（N=132）、ESD验证队列（VC1, N=42）和前瞻性验证队列（VC2, N=47），并记录了临床病理特征。
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蛋白质组学特征揭示T1期结直肠癌淋巴结转移的特征和风险
Proteomic characteristics reveal the signatures and the risks of T1 colorectal cancer metastasis to lymph nodes.
实验完整度
高包含蛋白质组学发现、机器学习模型构建与多队列验证、IHC验证、细胞功能实验等多个独立证据层级，并含机制验证。
主要模型
T1期结直肠癌患者FFPE肿瘤样本 结肠癌细胞系（SW480, HT29, HCT-116, RKO, DLD1, LoVo）
重点核对
训练队列（N=132）和验证队列（VC1, N=42; VC2, N=47）的患者样本 LNM状态（阴性/阳性） LASSO逻辑回归筛选的55个蛋白质标记物 RHOT2沉默对HT29细胞迁移的影响
摘要
淋巴结转移（LNM）的存在影响T1NxM0结直肠癌（CRC）的治疗策略决策，但目前基于临床病理的风险分层无法准确预测LNM。在本研究中，我们检测了143例LNM阴性和78例LNM阳性的T1期CRC患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤样本中的蛋白质，通过无标记液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）揭示了分子和生物学通路的变化，并建立了用于预测T1期CRC LNM的分类器。通过机器学习建立了一个有效的55蛋白质预测模型，并在训练队列（N=132）和两个验证队列（VC1，N=42；VC2，N=47）中进行了验证，在训练队列中实现了令人印象深刻的AUC为1.00，在VC1中为0.96，在VC2中为0.93。我们进一步构建了一个包含九种蛋白质的简化分类器，其AUC为0.824。该简化分类器在两个外部验证队列中表现优异。通过免疫组织化学验证了13种蛋白质的表达模式，并使用五种蛋白质的IHC评分构建了AUC为0.825的IHC预测模型。沉默RHOT2显著增强了结肠癌细胞的迁移和侵袭。我们的研究探索了T1期CRC转移的机制，可用于促进T1期CRC患者LNM的个体化预测，这可能为T1期CRC的临床实践提供指导。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- T1期结直肠癌中，哪些蛋白质组学特征能准确预测淋巴结转移，并揭示其潜在机制？
- 核心机制
- 上皮间质转化（EMT）通路在LNM阳性组显著富集，且与细胞骨架重塑和凝血级联的相互作用可能促进LNM；RHOT2低表达与LNM相关，其缺失可能通过影响线粒体功能增强癌症细胞迁移。
- 主要证据
- 基于221例FFPE样本的LC-MS/MS蛋白质组学数据，构建了55蛋白分类器并在训练和验证队列中达到高AUC；通过IHC验证了13种蛋白质，并用RHOT2沉默实验证实其增强结肠癌细胞迁移。
- 研究意义
- 该研究提供了基于蛋白质的预测模型，可更准确识别LNM风险，减少不必要的追加手术，并可能为T1期CRC的个体化治疗决策提供指导。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
蛋白质组学数据采集
获取T1期CRC样本的蛋白质表达谱，用于识别LNM相关特征。
使用无标记LC-MS/MS分析了所有样本的蛋白质组，共鉴定超过13,000个蛋白质组，每个样本鉴定超过4,000个蛋白质。
差异蛋白质与通路分析
识别LNM阴性和阳性组之间的蛋白质表达差异及富集通路。
通过Wilcoxon秩和检验等比较LNM阴性和阳性组的蛋白质表达，识别了82个和84个显著差异表达蛋白，并进行了GSEA和ssGSEA通路富集分析。
预测模型构建与验证
构建并验证能准确预测T1期CRC淋巴结转移的蛋白质分类器。
在训练队列中使用LASSO逻辑回归筛选出55个蛋白质，构建预测模型，并在VC1和VC2中验证。进一步简化得到9蛋白和5蛋白（IHC）模型。
细胞功能验证
验证RHOT2在结肠癌细胞迁移和侵袭中的功能作用。
在多种结肠癌细胞系中检测RHOT2表达，通过siRNA沉默HT29细胞中的RHOT2，并用transwell实验检测细胞迁移能力变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本制备 | 二硫苏糖醇 | Sigma | 43815 |
| 蛋白质消化 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| Microcon过滤管 | Sartorius | -- | |
| 质谱分析 | Q Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY nLC 1200液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫组织化学 | 抗ABI1抗体 | SignalwayAntibody | 36723 |
| 抗RHOT2抗体 | Proteintech | 11237-1-AP | |
| 抗ATAD2抗体 | Cell Signaling Technology | 78568 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning Costar | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | -- | -- | |
| 细胞迁移分析 | Transwell小室 | Corning Costar | 3422 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白质组学分析 | FFPE样本制备、LC-MS/MS参数、蛋白质鉴定和定量方法 阅读提示：Materials and methods: Sample preparation, Mass spectrometry analysis, Peptide and protein identification, Label-free-based MS quantification of proteins |
| 预测模型构建 | 训练队列样本、LASSO回归参数、55蛋白标记物列表 阅读提示：Results: Discriminative classifier to identify T1 CRC with LNM; Materials and methods: LNM prediction model |
| 免疫组织化学 | 抗体信息、染色评分系统 阅读提示：Materials and methods: Immunohistochemistry (IHC) staining |
| 细胞功能实验 | 细胞系、siRNA序列、转染条件、transwell实验条件 阅读提示：Materials and methods: Cell culture, transfection, and cell lines; Cell migration analysis |