单细胞转录组数据分析
鉴定HCC肿瘤微环境中B细胞和巨噬细胞亚群及其特征。
对GSE149614数据集的5979个细胞进行聚类分析，鉴定出PD-L1+ Bregs和CXCL12+ TAMs等亚群，并通过GSEA和GSVA分析其功能特征。
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肿瘤相关巨噬细胞通过CXCL12/CXCR4轴促进人肝细胞癌浸润B细胞PD-L1表达
Tumor-associated macrophages promoting PD-L1 expression in infiltrating B cells through the CXCL12/CXCR4 axis in human hepatocellular carcinoma.
实验完整度
高包含单细胞测序数据分析、体外巨噬细胞诱导与RNA-seq、多重免疫组化、流式细胞术、Western blot、RT-qPCR及原位小鼠模型等多个独立证据层级，并进行了功能验证与机制验证。
主要模型
人HCC组织样本（35例配对肿瘤及癌旁组织） THP1细胞系来源的巨噬细胞 小鼠原位肝癌模型（C57BL/6小鼠，Hep1-6细胞）
重点核对
PD-L1+ Bregs和CXCL12+ TAMs在HCC癌旁组织中的分布 CXCL12+ TAMs通过CXCL12/CXCR4轴调控B细胞PD-L1表达 MIF+ CAFs通过MIF/CD74轴招募巨噬细胞并诱导其分化为CXCL12+ TAMs CXCL12+ TAMs在小鼠原位肝癌模型中促进肿瘤生长和B细胞PD-L1表达
摘要
炎症相关的肿瘤微环境（TME）是肝癌发生的主要驱动因素之一。我们旨在通过重新分析HCC单细胞RNA-seq数据来研究肝细胞癌（HCC）中的细胞间通讯，并通过体外和体内研究证实这种细胞相互作用。我们发现了一个具有PD-L1表达的调节性B细胞亚群（PD-L1+ Bregs），主要位于HCC癌旁组织中。在与PD-L1+ Bregs共定位中，一个高表达CXCL12的肿瘤相关巨噬细胞亚群（CXCL12+ TAMs）也主要位于HCC癌旁组织中。此外，CXCL12+ TAMs可以在体外使用HCC条件培养基刺激。通过CellChat分析和多重免疫组化染色（mIHC），发现CXCL12+ TAMs首先通过CD74/巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）模式被癌症相关成纤维细胞（CAFs）招募，并进一步在富含TGF-β的组织中分化。此外，CXCL12+ TAMs通过CXCL12/CXCR4轴招募PD-L1+ Bregs，且CXCR4表达与PD-L1+ Bregs中的PD-L1表达显著正相关。最后，我们通过HCC原位小鼠模型证实了CAFs、巨噬细胞和B细胞之间的通讯及其促肿瘤作用。免疫抑制性HCC TME涉及细胞间通讯，包括分泌MIF的CAFs、分泌CXCL12的TAMs和产生PD-L1的Bregs，对它们的调控可能成为未来人类HCC免疫治疗中有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨HCC肿瘤微环境中细胞间通讯，特别是肿瘤相关巨噬细胞与调节性B细胞之间的相互作用及其对免疫抑制和肿瘤进展的影响。
- 核心机制
- MIF+ CAFs通过MIF/CD74轴招募巨噬细胞并诱导其分化为CXCL12+ TAMs，CXCL12+ TAMs再通过CXCL12/CXCR4轴调控B细胞PD-L1表达，促进免疫抑制微环境形成。
- 主要证据
- 单细胞RNA-seq分析、多重免疫组化、体外巨噬细胞诱导实验和小鼠原位肝癌模型验证了CXCL12+ TAMs与PD-L1+ Bregs的共定位及CXCL12/CXCR4轴介导的调控关系。
- 研究意义
- 揭示了HCC免疫抑制微环境中新型细胞间通讯机制，为未来免疫治疗提供了潜在的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
组织样本验证
验证单细胞测序发现的细胞亚群在HCC组织中的存在和分布。
使用包含35例配对肿瘤及癌旁组织的组织芯片进行多重免疫组化染色，检测PD-L1+ Bregs和CXCL12+ TAMs的数量和位置。
细胞间通讯分析
预测和验证HCC TME中细胞间配体-受体相互作用。
使用CellChat分析预测细胞间通讯，并通过多重免疫组化和相关性分析验证CXCL12+ TAMs与PD-L1+ Bregs之间的CXCL12/CXCR4轴以及MIF+ CAFs与CD74+ TAMs之间的MIF/CD74轴。
体外巨噬细胞诱导实验
验证HCC条件培养基对巨噬细胞CXCL12表达和分化的影响。
使用PMA处理的THP1细胞，以HCC组织裂解液制备的条件培养基刺激，通过RNA-seq分析基因表达变化，并通过GSVA和GSEA分析相关通路。
体外B细胞功能验证
验证CXCL12对B细胞PD-L1表达的调控作用。
从小鼠脾脏分离B细胞，经CXCL12刺激和CXCR4抗体共处理，通过Western blot和qPCR检测PD-L1表达。
体内小鼠模型验证
验证MIF+CAF-CXCL12+巨噬细胞-CXCR4+PD-L1+B细胞轴在体内的促肿瘤作用。
建立CCl4诱导的纤维化模型和原位肝癌模型，使用MIF抑制剂MIF098或过表达CXCL12的巨噬细胞过继转移联合CXCR4抑制剂AMD3100处理，评估肿瘤生长及免疫细胞浸润。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与刺激 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | Sigma | -- | |
| 流式细胞术 | 活力染料 | -- | -- |
| Fc受体阻断剂 | -- | -- | |
| 链霉亲和素 | -- | -- | |
| 组织处理 | 脱氧核糖核酸酶 | -- | -- |
| 透明质酸酶 | -- | -- | |
| 胶原酶 | -- | -- | |
| 细胞筛网 | BD Pharmingen | -- | |
| 多重免疫荧光 | 抗人Tim3抗体 | Signalway Antibody LLC | #28301 |
| 抗CD8抗体 | Cell Signaling Technology | C8/144B | |
| 抗CD163抗体 | Cell Signaling Technology | D6U1J | |
| 抗CD38抗体 | Proteintech | 25284-1-AP | |
| 抗IgA抗体 | Proteintech | 11449-1-AP | |
| 抗CXCL12抗体 | Proteintech | 17402-1-AP | |
| 抗CXCR4抗体 | Abcam | 60042-1-Ig | |
| 抗PD-L1抗体 | Abcam | ab58810 | |
| HRP标记的抗小鼠或抗兔IgG | PANOVUE | -- | |
| PPD 520/540/570/620/650/690/DAPI荧光染料 | PANOVUE | -- | |
| 动物实验 | MIF098 | Aobious | AOB33430 |
| AMD3100 | Selleckchem | S8030 | |
| RNA-seq | Illumina HiseqTM 2500/4000测序平台 | Illumina | -- |
| 多重免疫荧光 | Vectra 3自动化定量病理成像系统 | Akoya Biosciences | -- |
| inForm软件 | PerkinElmer | -- | |
| 流式细胞术 | LSRII流式细胞仪 | BD Bioscience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 样本来源：35例HCC患者的配对肿瘤及癌旁组织；排除标准：术前未接受抗癌治疗，无自身免疫性疾病、HIV感染或梅毒；TNM分期 阅读提示：Materials and methods: Clinical samples, Table 1 |
| 单细胞RNA-seq数据分析 | 数据集：GSE149614；低质量细胞过滤标准；聚类分析参数 阅读提示：Materials and methods: Data source, Processing of scRNA-seq data, Clustering analysis |
| 多重免疫组化 | 抗体种类及稀释比例；组织芯片制备方法 阅读提示：Materials and methods: Multiple-colored immunofluorescence (mIHC), Figure legends 2-4 |
| 体外巨噬细胞刺激 | THP1细胞培养条件；PMA浓度（5 ng/mL）及处理时间（48小时）；条件培养基制备及浓度（50 μg/mL） 阅读提示：Materials and methods: In vitro macrophage stimulation and RNA-seq |
| 体内动物模型 | 小鼠品系（C57BL/6）；纤维化模型建立（CCl4剂量及频率）；原位肝癌模型建立（Hep1-6细胞）；MIF098和AMD3100剂量及给药方式；巨噬细胞过继转移数量及频率 阅读提示：Materials and methods: An orthotopic mouse model of hepatocellular carcinoma |
| 流式细胞术 | 细胞制备方法；抗体染色方案（Table S1） 阅读提示：Materials and methods: Tumor infiltrating leukocytes extraction and flow cytometry |