定量巴豆酰化组学分析
鉴定缺氧条件下MDA-MB231细胞中全球巴豆酰化位点的变化。
使用TMT标记、免疫亲和富集和LC-MS/MS对比常氧和缺氧下MDA-MB231细胞的巴豆酰化水平。
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缺氧诱导的PGK1巴豆酰化下调通过协调糖酵解和三羧酸循环促进肿瘤发生
Hypoxia-induced downregulation of PGK1 crotonylation promotes tumorigenesis by coordinating glycolysis and the TCA cycle.
实验完整度
高包含定量蛋白质组学、细胞实验、体外生化实验、动物模型和临床样本等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
MDA-MB231乳腺癌细胞系 HEK293T细胞系 HCC1806乳腺癌细胞系 MCF10A正常乳腺上皮细胞系 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 MMTV-PyMT自发性乳腺癌小鼠模型
重点核对
缺氧处理时间：12小时，氧浓度0.5% PGK1 Kcr位点：K131、K156、K220，突变体K131R、K156R、K220R、3KR ECHS1敲低或过表达对PGK1 Kcr的影响 PDHK1敲低对PGK1 3KR介导的细胞增殖和肿瘤生长的影响 临床样本中PGK1 K131cr水平与乳腺癌分期和预后的关联
摘要
蛋白质翻译后修饰（PTMs）对于癌细胞适应缺氧至关重要；然而，赖氨酸巴豆酰化（Kcr）在缺氧中的功能意义仍不清楚。在此，我们报告了常氧和缺氧条件下全局巴豆酰化组的定量蛋白质组学分析，并展示了MDA-MB231细胞中101种蛋白的128个Kcr位点变化。具体而言，我们观察到缺氧时磷酸甘油酸激酶1（PGK1）的K131cr、K156cr和K220cr显著减少。烯酰辅酶A水合酶1（ECHS1）上调并与PGK1相互作用，导致缺氧下PGK1 Kcr下调。PGK1 Kcr的消除通过激活丙酮酸脱氢酶激酶1（PDHK1）促进糖酵解并抑制线粒体丙酮酸代谢。低PGK1 K131cr水平与乳腺癌的恶性肿瘤和不良预后相关。我们的发现表明PGK1 Kcr是协调糖酵解和三羧酸（TCA）循环的信号，可能作为乳腺癌的诊断指标。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 缺氧如何通过影响PGK1的巴豆酰化修饰来协调糖酵解和TCA循环，从而促进肿瘤发生？
- 核心机制
- 缺氧上调ECHS1转录，ECHS1与PGK1相互作用并降低PGK1 Kcr水平，导致PGK1与PDHK1结合增强，激活PDHK1磷酸化PDH，抑制线粒体丙酮酸代谢，同时促进糖酵解，最终促进肿瘤发生。
- 主要证据
- 定量蛋白质组学鉴定缺氧下PGK1 K131、K156、K220巴豆酰化显著降低；IP、GST pull-down证实ECHS1与PGK1互作并下调其Kcr；细胞和异种移植瘤实验证实PGK1 Kcr缺失激活PDHK1，促进增殖和肿瘤生长；临床样本分析显示低PGK1 K131cr与不良预后相关。
- 研究意义
- PGK1巴豆酰化作为协调糖酵解和TCA循环的信号，可能作为乳腺癌的诊断指标和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PGK1 Kcr位点验证及功能突变体构建
验证PGK1在K131、K156和K220位点的巴豆酰化，并构建突变体以研究其功能。
合成标准Kcr肽段对比MS谱图；构建单点（K131R、K156R、K220R）、双点和三点（3KR）突变体，转染HEK293T细胞进行IP和免疫印迹。
ECHS1介导的PGK1 Kcr下调机制研究
确定ECHS1是否在缺氧下介导PGK1巴豆酰化的下调。
通过IP-MS发现ECHS1为PGK1互作蛋白；Co-IP和GST pull-down验证相互作用；缺氧处理观察ECHS1表达和PGK1-ECHS1互作增强；敲低ECSH1观察PGK1 Kcr水平。
鉴定PGK1巴豆酰转移酶
寻找催化PGK1巴豆酰化的酶。
转染多种HATs和HDACs，IP分析鉴定PCAF为PGK1的巴豆酰转移酶；体外实验验证PCAF催化PGK1巴豆酰化。
PGK1巴豆酰化对代谢功能的影响
评估PGK1巴豆酰化缺失对糖酵解和线粒体丙酮酸代谢的影响。
在PGK1敲除的MDA-MB231细胞中回补rPGK1 WT或3KR，检测PDHK1和PDH磷酸化、OCR和ECAR、代谢物水平及ROS。
细胞功能实验
验证PGK1巴豆酰化缺失对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
使用集落形成、细胞增殖曲线、Transwell迁移和伤口愈合实验比较rPGK1 WT和3KR细胞的行为。
体内肿瘤生长实验
验证PGK1巴豆酰化缺失在体内对肿瘤生长的影响。
将MDA-MB231衍生的rPGK1 WT或3KR细胞（有或无PDHK1敲低）皮下注射到裸鼠，测量肿瘤体积和重量。
临床样本分析
评估PGK1 K131cr水平与乳腺癌患者预后和临床特征的关系。
使用组织芯片和IHC染色检测PGK1 K131cr、PGK1、ECHS1等表达，并分析其与生存期、分级、淋巴结转移的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹和IP | 抗PGK1抗体 | Proteintech | 17811-1-AP |
| 抗巴豆酰赖氨酸抗体 | PTM BIO | PTM-501 | |
| 抗ECHS1抗体 | Proteintech | 11305-1-AP | |
| 抗Flag M2抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 药物处理 | 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | S2889 |
| 代谢物检测 | 巴豆酰辅酶A三锂盐 | Sigma-Aldrich | 28007 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | C11875500BT | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| 转染 | Lipo8000转染试剂 | Beyotime | C0533 |
| 蛋白纯化 | GSTrap柱 | Cytiva | 17528201 |
| 还原型谷胱甘肽 | Solarbio | G8180 | |
| 酶活性测定 | TriStar² LB 942多功能微孔板读数仪 | Berthold Technologies | -- |
| 细胞培养耗材 | 基质胶 | BD-Biosciences | 356234 |
| 免疫荧光 | 线粒体示踪剂 | Invitrogen | 22425 |
| DAPI | -- | -- | |
| ROS检测 | H2DCFDA荧光探针 | MCE | HY-D0940 |
| 代谢物提取 | Oasis HLB固相萃取柱 | Waters | 186000383 |
| 代谢物检测 | 6500plus QTrap质谱仪 | AB SCIEX | -- |
| ACQUITY UPLC H-Class系统 | Waters | -- | |
| TSQ Quantiva质谱仪 | Thermo | -- | |
| Dionex Ulti-Mate 3000 UPLC系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Synergi Hydro-RP 100 A色谱柱 | Phenomenex | -- | |
| 蛋白纯化 | GST标记的PGK1蛋白 | -- | -- |
| His标记的ECHS1蛋白 | -- | -- | |
| His标记的PCAF蛋白 | -- | -- | |
| 细胞实验 | 嘌呤霉素 | Gibco | A1113803 |
| 杀稻瘟菌素 | Gibco | A1113903 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 缺氧处理 | 氧浓度：0.5% 阅读提示：见Methods中Cell lines and plasmids部分 |
| 缺氧处理 | 处理时间：12小时 阅读提示：见Methods中Cell lines and plasmids部分 |
| 细胞培养 | 培养基：DMEM或RPMI-1640，含10% FBS 阅读提示：见Methods中Cell lines and plasmids部分 |
| 转染 | 转染试剂：Lipo8000 阅读提示：见Methods中Cell lines and plasmids部分 |
| 免疫沉淀 | IP缓冲液成分：50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 阅读提示：见Methods中Immunoprecipitation and immunoblotting部分 |
| 免疫印迹 | PVDF膜：Millipore，IPVH00010 阅读提示：见Methods中Immunoprecipitation and immunoblotting部分 |
| 体外巴豆酰化实验 | 反应条件：5 μg GST-PGK1, 100 μM crotonyl-CoA, 0.5-2.5 μg His-PCAF, 30°C, 1小时 阅读提示：见Methods中In vitro crotonylation assays部分 |
| 酶活性测定 | 反应缓冲液：5 mM KH2PO4, 8 mM MgCl2, 1 mM GAP, 0.3 mM NAD, 0.2 mM ADP 阅读提示：见Methods中In vitro enzyme activity assay部分 |
| Seahorse分析 | OCR：细胞数1×10^5，XF24板，基础培养基为XF base medium 阅读提示：见Methods中ECAR和OCR部分 |
| Seahorse分析 | ECAR：细胞数3×10^4，XF96板 阅读提示：见Methods中ECAR和OCR部分 |
| 代谢物分析 | 培养基：无葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸的DMEM，补充10 mM葡萄糖和1 mM谷氨酰胺 阅读提示：见Methods中Targeted metabolites部分 |
| 同位素示踪 | 补充1 mM [U-13C3]-pyruvate 阅读提示：见Methods中Metabolite profiling和isotope tracing部分 |
| 动物实验 | 小鼠品系：BALB/c nude小鼠，6周龄，雌性 阅读提示：见Methods中Tumor xenografts in nude mice model部分 |
| 动物实验 | 细胞注射量：1×10^6细胞/只 阅读提示：见Methods中Tumor xenografts in nude mice model部分 |