PRGs表达谱分析
鉴定EC中差异表达的焦亡相关基因。
利用TCGA-UCEC和GTEx数据，对33个PRGs在肿瘤和正常组织中的表达进行比较，筛选出29个差异表达基因。
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细胞焦亡相关基因与子宫内膜癌的肿瘤免疫应答
Pyroptosis-associated genes and tumor immune response in endometrial cancer.
实验完整度
中包含TCGA数据挖掘、细胞系表达验证（RT-PCR和Western blot）及组织芯片多色免疫荧光验证，但缺乏功能实验和动物实验，证据层级有限。
主要模型
TCGA-UCEC队列（545例肿瘤样本，177例正常对照） 子宫内膜癌细胞系（AN3-CA、HEC-1B、KLE、Ishikawa、RL95-2） 正常子宫内膜上皮细胞（hEEC） 子宫内膜癌组织芯片（80对癌及癌旁组织）
重点核对
TCGA-UCEC队列样本量：545例肿瘤样本，177例正常对照 细胞系培养条件：DMEM-F12培养基，10% FBS，37°C，5% CO2 LASSO模型风险评分公式：风险评分 = (-0.3818)*NOD2 + (-0.0777)*CASP6 + (0.0681)*NLRP2 + (-0.3966)*GPX4 + (0.261)*PRKACA NOD2表达验证：在EC细胞系和80对组织芯片中验证，最佳截断值107.4（AUC=0.695） 组织芯片免疫荧光染色：使用抗NOD2、抗PDL1、抗PANCK、抗CD86抗体，稀释比1:200
摘要
肿瘤的发生和发展与细胞焦亡过程有关。然而，细胞焦亡相关基因（PRGs）在子宫内膜癌（EC）中的确切作用仍不确定。29个PRGs被鉴定为在EC中上调或下调。PRGs亚组分析显示，不同亚组的生存结局以及对化疗和免疫检查点阻断治疗的反应存在差异。GPX4和NOD2的高表达，以及CASP6、PRKACA和NLRP2的低表达，与较高的总生存（OS）率显著相关（p < 0.05）。相反，NOD2的低表达与较短的无进展生存期（p = 0.021）和较高的肿瘤分期（p = 0.0024）相关。NOD2、NLRP2和TNM分期被确定为独立的预后因素（p < 0.001）。LASSO预后模型显示，高风险评分组的EC患者OS显著降低（ROC-AUC10年：0.799，p = 0.00644）。此外，NOD2与免疫细胞浸润和免疫检查点表达呈正相关（p < 0.001）。GPX4和CASP6与TMB和MSI显著相关（RTMB = 0.39；RMSI = 0.23）。此外，在EC细胞和组织中均证实NOD2显著上调，表明其与晚期TNM分期（p < 0.0001）和M1表型巨噬细胞浸润呈正相关。然而，其对患者OS的影响未达到统计学显著性（p = 0.141）。我们的研究结果有助于推进EC患者的预后模型。NOD2受体介导的细胞焦亡机制可能调节肿瘤免疫，并促进巨噬细胞从M2表型向M1表型转化，这对EC的进展有显著影响。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞焦亡相关基因在子宫内膜癌中的表达、预后价值及其与肿瘤免疫浸润的关系。
- 核心机制
- NOD2受体介导的细胞焦亡可能通过促进巨噬细胞从M2表型向M1表型转化来调节肿瘤免疫，从而影响EC进展。
- 主要证据
- 基于TCGA数据发现NOD2与免疫细胞浸润和免疫检查点表达正相关；在细胞系和组织芯片中验证NOD2高表达，并与M1巨噬细胞标志物CD86相关。
- 研究意义
- 研究提供了EC的预后模型，并提示NOD2可作为免疫治疗的潜在靶点，有助于个性化治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PRGs亚组分析
根据PRGs表达进行分子分型，并评估各亚组的预后和药物敏感性。
使用ConsensusClusterPlus包对545例EC样本进行一致性聚类，分为3个亚组，比较亚组间的OS、化疗药物IC50和免疫治疗反应。
预后模型构建与验证
构建并验证基于PRGs的预后模型。
使用LASSO-Cox回归分析筛选出5个预后相关PRGs构建风险评分模型，并对患者进行风险分层。
免疫浸润和免疫检查点分析
探究PRGs与肿瘤免疫微环境的关系。
使用TIMER算法评估免疫细胞浸润，分析PRGs与免疫检查点基因、TMB和MSI的相关性。
细胞系表达验证
验证5个PRGs在EC细胞系中的表达。
在5种EC细胞系和正常子宫内膜上皮细胞中，通过RT-PCR和Western blot检测mRNA和蛋白表达。
组织芯片验证
在临床组织样本中验证NOD2的表达及其与生存和免疫标志物的关系。
使用包含80对EC和癌旁组织的组织芯片，通过多色免疫荧光染色检测NOD2、CD86、PDL1和PANCK的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM-F12培养基 | HyClone | SH30234.01 |
| 上皮细胞培养基 | ScienCell | 4101 | |
| RT-PCR | Trizol试剂 | -- | -- |
| TAKARA逆转录试剂盒 | TAKARA | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 增强化学发光试剂 | Millipore | WBKLS0500 | |
| 多重免疫组化 | 抗NOD2抗体 | Signalway Antibody | 54121 |
| 抗PDL1抗体 | Abcarta | PA167 | |
| 抗PANCK抗体 | Abcarta | PA125 | |
| 抗CD86抗体 | Abcarta | PA250 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 数据获取与处理 | TCGA-UCEC数据集版本和样本数（545例），GTEx正常样本数（177例），33个PRGs列表，数据标准化方法（TPM） 阅读提示：Materials and methods: Datasets |
| 亚组分析 | ConsensusClusterPlus参数（最大聚类数6，迭代次数100，抽样比例80%，聚类算法hc，链接方法ward.D2） 阅读提示：Materials and methods: Subgroup analysis of PRGs genes |
| 预后模型构建 | LASSO回归参数（10折交叉验证），风险评分公式，最佳截断值（中位风险评分） 阅读提示：Materials and methods: Construction of the PRGs prognostic model |
| 细胞系培养与表达验证 | 细胞系来源（ATCC），培养条件（DMEM-F12培养基，10% FBS，37°C，5% CO2），RT-PCR所用引物序列，Western blot抗体及稀释比例（1:1000） 阅读提示：Materials and methods: Cell lines and culture, RT-PCR, Western blots |
| 组织芯片验证 | 组织芯片来源（上海廖丁生物科技有限公司，EC1601），样本数（80对癌及癌旁组织），抗体信息及稀释比例（1:200） 阅读提示：Materials and methods: Multiplex immunohistochemistry assay |