ZnT1 蛋白表达与纯化
获得用于结构研究的均一、单分散的 ZnT1 蛋白样品
在 HEK293F 细胞中过表达 C 端带 FLAG 标签的全长 ZnT1，经亲和纯化和凝胶过滤层析，使用 LMNG/CHS 去垢剂体系提取。
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人锌转运体 ZnT1 介导的 Zn2+ 外排的结构学见解
Structural insights into human zinc transporter ZnT1 mediated Zn2+ efflux.
实验完整度
高包含冷冻电镜结构解析（多个构象）、分子动力学模拟，以及基于细胞的功能实验（Zn2+ 外排活性检测），证据层级相互独立。
主要模型
人胚胎肾 HEK293 细胞系（Expi293F、HEK293T） 全长人 ZnT1 蛋白样品 截短的人 ZnT3 蛋白样品 WT 和突变体 ZnT1/ZnT3 稳定转染的 HEK293T 细胞
重点核对
ZnT1 蛋白纯化使用 LMNG/CHS 去垢剂体系 pH 6.0 与 1 mM ZnSO4 孵育以捕获内向开放构象 Zn2+ 外排实验使用 60 μM ZnSO4 和 1 μM FluoZin-3 AM 处理 50 分钟 MD 模拟采用 CHARMM-GUI 构建 POPC 膜体系，运行 500 ns 所有结构解析均使用单颗粒冷冻电镜技术
摘要
锌转运体 1 (ZnT1) 是细胞质锌转运至细胞外环境的主要载体，对细胞锌稳态和抵抗锌毒性至关重要。尽管近年来多种锌转运体结构表征取得了进展，但 ZnTs 介导的 Zn2+ 转运如何与 H+ 或 Ca2+ 偶联的机制仍不清楚。为了可视化转运动态，我们确定了人 ZnT1 在不同功能状态下的冷冻电镜 (cryo-EM) 结构。ZnT1 通过胞质域 (CTD)、跨膜域 (TMD) 和独特的富含半胱氨酸的胞外域 (ECD) 之间的广泛相互作用形成二聚体。在 pH 7.5 时，两个原聚体均采用外向开放 (OF) 构象，Zn2+ 离子在 TMD 结合位点由不同的氨基酸组成配位。在 pH 6.0 时，与 Zn2+ 结合的 ZnT1 呈现多种构象 [OF/OF、OF/IF (内向开放) 和 IF/IF]。这些构象快照，连同生化研究和分子动力学模拟，揭示了 ZnT1 转运的质子依赖性机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人 ZnT1 如何介导 Zn2+ 外排，以及其转运如何与质子梯度偶联？
- 核心机制
- ZnT1 通过摇杆束运动实现交替开放：胞质 Zn2+ 结合内向开放构象的 TMD 位点，触发 TM1、2、4、5 束摆动至外向开放，随后 His43 和 His251 质子化导致 Zn2+ 释放，并可能复位至内向开放状态以进行下一轮转运。
- 主要证据
- cryo-EM 结构捕获了 ZnT1 在 pH 6.0 条件下的 OF/OF、OF/IF 和 IF/IF 构象，且 IF 态 Zn2+ 由四合配位网络螯合；分子动力学模拟显示 His43 和 His251 质子化影响 Zn2+ 结合；点突变 H43A 显著降低 Zn2+ 外排活性。
- 研究意义
- 该研究揭示了 ZnT1 介导 Zn2+/H+ 交换的结构基础，为理解 ZnT 家族转运机制提供见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Zn2+ 结合状态结构解析
捕获 Zn2+ 结合时的外向开放构象，观察配位网络
在 pH 7.5 含 1 mM ZnSO4 条件下制备样品，进行单颗粒冷冻电镜数据收集和结构解析，获得 2.65 Å 分辨率的 OF/OF 二聚体结构。
低 pH 条件下的构象动态分析
探究质子依赖的构象变化，观察是否出现内向开放状态
在 pH 6.0 含 1 mM ZnSO4 条件下制备样品，通过广泛的颗粒分类获得三种主要构象（OF/OF、OF/IF、IF/IF），并比较各构象 TMD 界面和配位网络。
ZnT3 低 pH 结构验证
验证低 pH 下 ZnT 家族是否普遍采用内向开放构象
在同样低 pH 条件下制备 ZnT3 样品，解析了 IF/IF 同型二聚体结构，并检查其与 ZnT1 结构的保守性。
分子动力学模拟
模拟 Zn2+ 识别和质子化对 Zn2+ 释放的影响
基于 cryo-EM 结构进行全原子 MD 模拟，观察 Zn2+ 结合、His43/His251 质子化引起的构象变化以及 Zn2+ 释放过程。
锌外排功能实验
验证关键残基及缺失突变对 ZnT1 转运活性的影响
利用稳定表达 ZnT1 WT 或突变体的 HEK293T 细胞，进行 FluoZin-3 AM 荧光检测，比较细胞内锌水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | Expi293F 细胞 | ThermoFisher Scientific | Cat # A14527 |
| 细胞培养 | HEK293T 细胞 | ATCC | Cat # CRL-11268 |
| 蛋白表达 | 聚乙烯亚胺 | Bioon | -- |
| 丁酸钠 | Aladdin | Cat # S102956 | |
| 蛋白纯化 | 正十二烷基-β-D-麦芽糖苷 | Anatrace | Cat # D310 |
| 胆固醇半琥珀酸酯 | Anatrace | Cat # CH210 | |
| 十二烷基麦芽糖新戊二醇 | Anatrace | Cat # NG310 | |
| 3×FLAG 肽 | Smart-Lifesciences | Cat # SLR01002 | |
| 抗 DYKDDDDK(FLAG) 亲和树脂 | Smart-Lifesciences | Cat # SA042100 | |
| Superose 6 增加 10/300 GL | GE Healthcare | Cat# 29091596 | |
| 细胞培养 | DMEM 基础培养基 | Gibco | Cat # C11995500BT |
| 胎牛血清 | Excell | Cat # FSP500 | |
| 锌外排实验 | FluoZin-3 | ThermoFisher Scientific | Cat # F24195 |
| 1,10-菲咯啉 | Sigma | Cat# 131377 | |
| 细胞培养 | PDL（聚-D-赖氨酸）包被的 20 mm 玻底培养皿 | Sorfa Life Science | Cat # 201100 |
| Western blot | 兔抗 HA 抗体 | Cell Signaling Technology | Cat # 3724 |
| 兔抗 β-肌动蛋白 | Proteintech | Cat # 20536-1-AP | |
| 小鼠抗 DYKDDDK 抗体 | ABmart | Cat # M20008 | |
| 兔抗钠钾 ATP 酶 | ABmart | Cat # M40013s | |
| HRP 标记的山羊抗兔抗体 | Signalway Antibody | Cat # L3012 | |
| HRP 标记的山羊抗小鼠抗体 | Signalway Antibody | Cat # L3032 | |
| 冷冻电镜 | Quantifoil R 1.2/1.3 网格 Au300 | Quantifoil | Cat# Q37572 |
| 滤纸 | Ted Pella | Cat # 47000-100 | |
| Titan Krios 冷冻电镜 | ThermoFisher | -- | |
| K3 直接电子检测器 | Gatan | -- | |
| BioQuantum 能量过滤器 | Gatan | -- | |
| Falcon G4i 直接电子检测器 | ThermoFisher | -- | |
| Selectris X 成像过滤器 | ThermoFisher | -- | |
| Vitrobot Mark IV | FEI | -- | |
| PELCO easiGlo 仪器 | Ted Pella | -- | |
| Western blot | ChemiDoc MP 成像系统 | Bio-Rad | -- |
| High-sig ECL 蛋白质印迹底物 | Tanon | -- | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ZnT1 蛋白表达与纯化 | HEK293F 细胞密度 2×10^6 mL^-1；质粒 1 mg；PEI 3 mg；丁酸钠 10 mM；表达时间 60 h；LMNG/CHS 浓度；SEC 缓冲液成分 阅读提示：Methods: Cloning and protein expression, ZnT1 purification |
| 结构样品制备 | Zn2+ 浓度 1 mM；pH 7.5 或 pH 6.0；低 pH 缓冲液使用 50 mM MES；去垢剂 LMNG/CHS 浓度 阅读提示：Methods: ZnT1 purification; 图注 Figure 3 和 Figure 4 |
| 冷冻电镜数据收集 | 加速电压 300 kV；像素大小；总剂量 52 e-/Å2 或 50 e-/Å2；能量过滤器狭缝宽度 阅读提示：Methods: Cryo-EM sample preparation and data collection |
| 锌外排实验 | 细胞密度 6×10^4 cells/dish；ZnSO4 60 μM；FluoZin-3 AM 1 μM；处理时间 50 min；荧光显微镜型号 Leica SP8；图像分析软件 ImageJ 阅读提示：Methods: Zn2+ transport assay; 图注 Figure 2B 和 Figure 6B |
| 分子动力学模拟 | 力场参数；POPC 膜；离子浓度；模拟时间；温度 310 K；压力 1 bar 阅读提示：Methods: Molecular dynamics simulations |