细胞系筛选与特征评估
评估多种结直肠癌细胞系的球体形成能力、迁移能力及FAK/AKT/干细胞标志物表达，选择后续实验的细胞系。
检测HT29、HCT116、SW480、SW620和RKO五种细胞系的球体形成、迁移能力及FAK、p-FAK、AKT、p-AKT和干细胞标志物表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
FAK下调抑制人结直肠癌细胞的干细胞样特性和迁移
FAK downregulation suppresses stem-like properties and migration of human colorectal cancer cells.
实验完整度
中包含细胞功能实验（球体形成、划痕愈合）、蛋白表达检测（Western blot、免疫细胞化学）、机制验证（免疫共沉淀）和抑制剂处理，但缺乏动物模型和患者样本。
主要模型
HT29人结直肠癌细胞系 RKO人结直肠癌细胞系 HCT116、SW480、SW620人结直肠癌细胞系（初步筛选）
重点核对
细胞系：HT29和RKO FAK抑制剂PF-562271处理浓度：5 μM，处理时间：24小时 AKT抑制剂MK-2206 2HCl处理浓度：25 μM，处理时间：24小时 FAK敲低：Lenti-FAK-EGFP-miR转染RKO细胞，MOI=30 球体形成实验：1000细胞/孔，非贴壁6孔板，培养7天，计数直径>75 μm的球体
摘要
黏着斑激酶(FAK)是一种细胞质蛋白酪氨酸激酶，在结直肠癌细胞中过表达。FAK可通过磷酸化激活，参与多种信号通路的转导和癌症干细胞的自我更新。FAK的下调是否通过减弱干细胞样特性抑制结直肠癌转移及其机制尚未明确。CD44、CD133、c-Myc、Nanog和OCT4已知可标记结直肠癌干细胞特性。在本研究中，AKT抑制剂(MK-2206 2HCl)或FAK抑制剂(PF-562271)降低了结直肠癌中干细胞标志物(Nanog、OCT4、CD133、CD44、c-Myc)的表达和球体形成。此外，通过免疫共沉淀验证了FAK和AKT蛋白存在相互作用。进一步，通过向结直肠癌细胞转染Lenti-FAK-EGFP-miR下调FAK，降低了p-AKT而非AKT的水平，并降低了干细胞标志物的表达和球体形成。总之，我们证明FAK的下调抑制结直肠癌细胞的干细胞样特性和迁移，部分原因是由于FAK对AKT磷酸化的调节改变所致。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FAK的下调是否通过减弱干细胞样特性抑制结直肠癌转移，及其潜在机制。
- 核心机制
- FAK通过调控AKT磷酸化（而非AKT总蛋白水平）来调节结直肠癌细胞的干细胞样特性和迁移能力。
- 主要证据
- FAK抑制剂PF-562271和AKT抑制剂MK-2206 2HCl均降低干细胞标志物表达和球体形成；FAK敲低降低p-AKT、干细胞标志物、球体形成和迁移；免疫共沉淀证实FAK与AKT相互作用。
- 研究意义
- FAK是结直肠癌治疗的潜在肿瘤抑制靶点，消除具有干细胞样特性的细胞可能改善结直肠癌患者的临床结局。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
AKT抑制对细胞功能的影响
验证AKT抑制是否通过降低p-AKT影响结直肠癌细胞干性和迁移。
用AKT抑制剂MK-2206 2HCl处理HT29和RKO细胞，检测干细胞标志物表达、球体形成和迁移能力。
FAK抑制对细胞功能的影响
验证FAK抑制是否通过FAK/p-FAK/p-AKT轴影响结直肠癌细胞干性和迁移。
用FAK抑制剂PF-562271处理HT29和RKO细胞，检测FAK、p-FAK、p-AKT、干细胞标志物表达、球体形成和迁移能力。
FAK敲低对细胞功能的影响
验证FAK下调是否通过降低p-AKT抑制结直肠癌细胞干性和迁移。
用Lenti-FAK-EGFP-miR稳定转染RKO细胞敲低FAK，检测FAK mRNA和蛋白水平、p-AKT、干细胞标志物表达、球体形成和迁移能力。
FAK与AKT相互作用验证
验证FAK与AKT蛋白是否直接相互作用，支持FAK调控AKT磷酸化的机制。
通过免疫共沉淀（co-IP）检测RKO细胞中FAK与AKT的相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | -- | |
| 表皮生长因子 | PeproTech | AF 10015 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | PeproTech | 10018 B | |
| B27添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| 球体形成实验 | 非贴壁6孔板 | Corning | 3471 |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | -- | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| Odyssey红外成像系统 | LI-COR | -- | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-1g | |
| FAK抗体 | Proteintech | 12636-1-AP | |
| CD133抗体 | Proteintech | 18470-1-AP | |
| CD44抗体 | Proteintech | 15675-1-AP | |
| Nanog抗体 | Proteintech | 14295-1-AP | |
| Sox2抗体 | Proteintech | 66411-1-1g | |
| c-Myc抗体 | Proteintech | 10828-1-AP | |
| 磷酸化AKT (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| 磷酸化FAK (Tyr397)抗体 | Signalway Antibody | 11215 | |
| OCT4抗体 | Wanleibio | WL02020 | |
| IRDye 680RD羊抗兔二抗 | LI-COR | 926-68071 | |
| IRDye 680RD羊抗小鼠二抗 | LI-COR | 925-68070 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | 日本同仁 | 5007 |
| 酶标仪 | BioTek | ELX800 | |
| 药物处理 | PF-562271 | Selleck | -- |
| MK-2206 2HCl | Selleck | -- | |
| 免疫组织化学 | 甲醇 | -- | -- |
| 过氧化氢 | -- | -- | |
| 正常山羊血清 | -- | -- | |
| 生物素化二抗 | -- | -- | |
| 亲和素/生物素复合物 | -- | -- | |
| DAB显色液 | -- | -- | |
| Image Pro Plus图像分析软件 | -- | -- | |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G琼脂糖珠 | Pierce | 78609 |
| 非免疫血清 | -- | -- | |
| 兔抗IgG | -- | -- | |
| 2x上样缓冲液 | -- | -- | |
| 增强化学发光试剂 | Pierce | -- | |
| 医用X光胶片 | -- | -- | |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒 | TIANGEN | -- |
| 逆转录试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| SYBR Green预混液 | Roche | -- | |
| 实时荧光定量PCR仪 | ABI | -- | |
| GAPDH引物 | TaKaRa | -- | |
| FAK引物 | TaKaRa | -- | |
| 转染 | 慢病毒-FAK-EGFP-miR | 上海R&S生物技术有限公司 | -- |
| 慢病毒-EGFP-miR（对照） | 上海R&S生物技术有限公司 | -- | |
| 划痕愈合实验 | 尼康显微镜软件 | Nikon | -- |
| 统计分析 | SPSS 20.0 | IBM | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系选择 | HT29和RKO细胞系；其他细胞系（HCT116、SW480、SW620）也有检测 阅读提示：见Materials and methods: Cell culture and transfection; Results: 第一部分 |
| 抑制剂处理 | MK-2206 2HCl浓度25 μM，处理24小时；PF-562271浓度5 μM，处理24小时 阅读提示：见Materials and methods: Cell viability; Results: 关于抑制剂的部分 |
| FAK敲低 | Lenti-FAK-EGFP-miR转染RKO细胞，MOI=30；对照Lenti-EGFP-miR 阅读提示：见Materials and methods: Cell culture and transfection |
| 球体形成实验 | 细胞接种密度1×10^3/孔，非贴壁6孔板，培养7天，计数直径>75 μm的球体 阅读提示：见Materials and methods: Spheroid formation assay |
| Western blot | 抗体稀释比例：GAPDH 1:2000, FAK 1:2000, CD133 1:1000, CD44 1:2000, Nanog 1:2000, Sox2 1:2000, c-Myc 1:1000, p-AKT 1:1000, AKT 1:1000, FAK pY397 1:1000, OCT4 1:1000；二抗1:10000 阅读提示：见Materials and methods: Western blotting analysis |
| 划痕愈合实验 | 细胞铺板至80-90%汇合度，划痕，0h和24h观察迁移距离 阅读提示：见Materials and methods: Wound healing assay |
| 免疫共沉淀 | 使用10 μg抗FAK抗体，Protein G Sepharose，IgG对照 阅读提示：见Materials and methods: Co-Immunoprecipitation |