蛋白质组学鉴定胞质和ER多聚体相互作用因子
鉴定不同区室多聚体相关的蛋白质，发现空间调节的翻译调控因子。
分离U2OS细胞胞质和ER组分，通过蔗糖梯度离心和oligo-dT亲和层析获得多聚体，并进行质谱分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
丙酮酸激酶M（PKM）以poly-ADP核糖化依赖的方式结合核糖体，诱导翻译停滞。
Pyruvate Kinase M (PKM) binds ribosomes in a poly-ADP ribosylation dependent manner to induce translational stalling.
实验完整度
高包含蛋白质组学、eCLIP-seq、核糖体足迹测序、体外结合实验、功能验证及PARylation机制验证。
主要模型
U2OS细胞 HEK293T细胞 HEK293F细胞 HepG2细胞
重点核对
PKM与多聚体相互作用依赖于葡萄糖/丙酮酸，饥饿3小时降低共分离 ADP外源添加破坏PKM与核糖体的共沉降 eCLIP在HepG2细胞中鉴定PKM2结合编码赖氨酸和谷氨酸富集区下游的mRNA 核糖体足迹测序显示PKM敲低降低eCLIP靶标的核糖体占据 Olaparib抑制PARylation消除PKM与多聚体的共沉降
摘要
鉴于大量研究鉴定出内质网（ER）表面的转录后调控因子，我们提出了一个问题：在人类细胞中是否存在调控区室特异性mRNA翻译的因子。通过空间调控的多聚体相互作用蛋白的蛋白质组学调查，我们将糖酵解酶丙酮酸激酶M（PKM）鉴定为胞质（即非ER）多聚体相互作用蛋白，并研究了它如何影响mRNA翻译。我们发现PKM-多聚体相互作用直接受ADP水平调控——这提供了碳水化合物代谢与mRNA翻译之间的联系。通过增强的交联免疫沉淀测序（eCLIP-seq），我们发现PKM与编码赖氨酸和谷氨酸富集区的下游mRNA序列交联。利用核糖体足迹保护测序，我们发现PKM与核糖体的结合导致接近赖氨酸和谷氨酸编码序列的翻译停滞。最后，我们观察到PKM募集到多聚体依赖于poly-ADP核糖化活性（PARylation）——并且可能依赖于新生多肽链的赖氨酸和谷氨酸残基的共翻译PARylation。总的来说，我们的研究揭示了PKM在转录后基因调控中的新作用，将细胞代谢与mRNA翻译联系起来。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类细胞中是否存在调控区室特异性mRNA翻译的因子，以及PKM如何影响翻译？
- 核心机制
- PKM通过poly-ADP核糖化识别新生多肽链，结合核糖体并导致翻译停滞，且该相互作用受ADP水平调控。
- 主要证据
- 质谱分析、eCLIP-seq、核糖体足迹测序、35S标记实验和体外结合实验。
- 研究意义
- 揭示PKM在转录后基因调控中的新作用，将细胞代谢与mRNA翻译联系起来。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证PKM与多聚体的葡萄糖依赖结合
测试PKM与多聚体的结合是否受糖酵解状态影响。
对U2OS细胞进行葡萄糖/丙酮酸饥饿或2-DG处理，通过蔗糖梯度或蔗糖垫离心分析PKM的共分离。
鉴定PKM2的RNA结合靶点
确定PKM2结合的mRNA序列特征。
在HepG2细胞中进行eCLIP-seq，鉴定PKM2交联的RNA峰。
验证PKM与核糖体的直接结合
确认PKM直接与核糖体结合并测定亲和力。
使用重组GST-PKM1与盐洗核糖体共沉降，以及微量热泳动测定结合亲和力。
研究PKM对核糖体占据和翻译的影响
测试PKM敲低对核糖体占据和翻译效率的影响。
在HEK293T细胞中用shRNA敲低PKM，进行核糖体图谱分析和RNA测序，并用35S标记检测蛋白质合成。
验证PKM依赖的翻译停滞
确认PKM在特定mRNA上促进核糖体停顿。
在核糖体图谱数据中识别停滞位点，并通过Northern blot验证HSP90AA1 mRNA上的停滞。
研究PARylation对PKM与多聚体结合的作用
测试PARylation是否影响PKM与多聚体的结合。
用Olaparib抑制PARP，通过蔗糖垫离心分析PKM的共沉降，并使用生物素化嘌呤霉素标记新生链，链霉亲和素下拉检测PAR化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11966-025 |
| 药物处理 | 2-脱氧葡萄糖 | Sigma | D8375 |
| 奥拉帕尼 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 溴化己二甲铵 | Sigma | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 蛋白/RNA分离 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| RNA免疫沉淀 | 核糖核酸酶I | LifeTech | -- |
| PKM2抗体 | Sigma | SAB4200105 | |
| Dynabeads M-280羊抗兔IgG磁珠 | LifeTech | -- | |
| Dynabeads MyONE硅烷磁珠 | LifeTech | -- | |
| RNA测序库制备 | Q5聚合酶 | NEB | -- |
| Agencourt AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| RNA测序 | HiSeq 4000测序仪 | Illumina | -- |
| NovaSeq SP测序仪 | Illumina | -- | |
| 微量热泳动 | Monolith NT.115微量热泳动仪 | NanoTemper Technologies | -- |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | -- | -- |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 胸腺嘧啶核苷 | -- | -- | |
| 脱氧胞苷 | -- | -- | |
| 诺考达唑 | -- | -- | |
| 蛋白质分析 | Laemmli缓冲液 | -- | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Trizol-LS试剂 | Thermofisher | 10296010 | |
| 蛋白质结合实验 | GST-PKM1重组蛋白 | -- | -- |
| 蛋白质标记 | 荧光素-5-琥珀酰亚胺酯 | Invitrogen | -- |
| 放射性标记 | 半胱氨酸/蛋氨酸蛋白质标记 | Perkin-Elmer | NEG772002MC |
| 免疫沉淀 | 抗微管蛋白抗体 | Sigma | DM1A |
| 抗G3BP2抗体 | Proteintech | 16276-1-AP | |
| 免疫印迹 | 抗醛缩酶A抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Sigma | DM1A | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma | -- | |
| 核糖体图谱 | 核糖核酸酶I | Invitrogen | AM2249 |
| 核糖核苷钒复合物 | NEB | S1402S | |
| QIAzol裂解试剂 | Qiagen | -- | |
| miRNeasy试剂盒 | Qiagen | -- | |
| D-Plex小RNA测序试剂盒 | Diagenode | -- | |
| RNA-seq | CATS RNA-seq试剂盒v2 | Diagenode | C05010045 |
| RT-qPCR | Power SYBR Green预混液 | -- | -- |
| Superscript逆转录酶IV | Invitrogen | -- | |
| ViiA 7实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Northern blot | T4多核苷酸激酶 | NEB | M0201S |
| Cytiva G-25 MicroSpin柱 | Cytiva | 27532501 | |
| Amersham Hybond-N+尼龙膜 | Cytiva | -- | |
| 新生肽分析 | 生物素-dC-嘌呤霉素 | Jena Bioscience | -- |
| 链霉亲和素磁珠 | ThermoFisher | 20347 | |
| 试剂 | AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- |
| MinElute凝胶回收试剂盒 | Qiagen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和PKM敲低 | 细胞系（U2OS、HEK293T等）、培养基（DMEM+10%FBS）、PKM shRNA序列（TRCN0000199494）、嘌呤霉素筛选浓度（2 μg/ml）和时间（6天） 阅读提示：Materials and Methods: Cells, growth conditions, and lentiviral mediated depletion of PKM |
| 多聚体分离 | 细胞数量（75×10^6）、环己酰亚胺浓度（10 μg/ml）和处理时间（30分钟）、裂解缓冲液成分、蔗糖垫离心条件（90,000 RPM，40分钟） 阅读提示：Materials and Methods: Cell fractionation and oligo-dT affinity chromatography |
| 葡萄糖/丙酮酸饥饿 | 饥饿培养基（无葡萄糖/丙酮酸DMEM）、处理时间（3小时）、2-DG浓度（20 mM） 阅读提示：Materials and Methods: Cells, growth conditions...；Figure 2 legend |
| eCLIP-seq | 细胞系（HepG2）、UV交联剂量（254 nm, 400 mJ/cm2）、RNase I用量（40 U）、PKM2抗体（SAB4200105）、文库制备试剂盒、测序平台（HiSeq 4000） 阅读提示：Materials and Methods: eCLIP sequencing library preparation |
| 核糖体图谱分析 | 细胞系（HEK293T）、环己酰亚胺浓度（100 μg/ml）、RNaseI用量（5 μl）、文库制备试剂盒（D-Plex Small RNA-Seq Kit）、测序平台（NovaSeq SP） 阅读提示：Materials and Methods: Ribosome footprint profiling |
| PARylation抑制实验 | Olaparib浓度（15 μM）、处理时间（25分钟）、对照（DMSO） 阅读提示：Materials and Methods: Cells, growth conditions...；Figure 5 legend |