动物模型构建与同步化
建立WT和DKO小鼠模型并同步昼夜节律
使用6周龄雄性WT C57BL/6J小鼠和Per1/Per2 DKO小鼠，在12小时光/12小时暗条件下同步至少1周，然后转入持续黑暗，采集8种组织样本。
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野生型和Per1-/-/Per2-/-小鼠的多组织昼夜节律蛋白质组图谱
Multitissue Circadian Proteome Atlas of WT and Per1-/-/Per2-/- Mice.
实验完整度
高包含TMT定量蛋白质组学、RNA-seq、Western blot、运动活动监测、体内基因敲除模型、多个组织和时间点采样、MetaCycle等分析方法，并进行了生物和技术重复验证。
主要模型
野生型C57BL/6J小鼠 Per1/Per2双敲除（DKO）小鼠 多组织样本（SCN区域、丘脑、肝、胆囊胆汁、棕色脂肪、肾、心、腓肠肌）
重点核对
样本采集时间跨度46小时，间隔2小时，共24个时间点 使用TMT 10plex和TMTpro 16plex标记进行蛋白质组学分析 MetaCycle参数设置：最小周期23.1，最大周期24.9，默认周期23.7 蛋白质周期因子定义为meta2d_pvalue <0.1且rAMP ≥0.1
摘要
昼夜节律的分子基础由Per1/2等核心时钟基因驱动，已在转录组水平上得到研究，但尚未在蛋白质组水平上进行全面研究。在这里，我们使用野生型和Per1/Per2双敲除小鼠模型，在46小时内以2小时间隔对八种组织类型中表达的超过11000种蛋白质进行了定量。野生型小鼠的多组织昼夜节律蛋白质组图谱显示出组织特异性模式，并反映了昼夜节律预期现象，而这些在转录水平上不太明显。在双敲除小鼠的大多数外周组织中，与野生型小鼠相比，鉴定到的蛋白质周期因子减少。此外，PER1/2有助于控制昼夜节律的预期，调节组织特异性周期因子以及包括核苷酸切除修复在内的关键通路。在缺乏Per1和Per2的情况下，观察到昼夜节律蛋白质组的严重组织间时间失调。γ-氨基丁酸可能调节野生型小鼠中一些时间相关的周期因子。我们的研究加深了对跨多个组织节律性蛋白质的理解，并为时间化疗提供了有价值的见解。数据可在https://prot-rhythm.prottalks.com/获取。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在蛋白质组水平上，PER1/2如何调控多组织昼夜节律？
- 核心机制
- PER1/2通过转录-翻译反馈环路控制核心时钟蛋白节律，并调控组织特异性周期因子及核苷酸切除修复等关键通路。
- 主要证据
- 基于WT和DKO小鼠多组织TMT定量蛋白质组学（11651种蛋白质）和MetaCycle分析，发现4749个WT周期蛋白和1973个DKO周期蛋白，PER依赖基因敲除导致多数组织周期蛋白减少，SCN区域除外；核苷酸切除修复通路振荡在DKO中减弱。
- 研究意义
- 研究提供了多组织昼夜节律蛋白质组图谱，加深了对节律蛋白的理解，并为时间化疗提供见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
组织样本采集与制备
获取不同组织在不同时间点的蛋白质组样本
在持续黑暗中每2小时采集一次脑（SCN区域、丘脑）、肝、胆囊胆汁、棕色脂肪、肾、心、腓肠肌，共24个时间点，样本经液氮速冻。
TMT定量蛋白质组学分析
测定各组织样本中蛋白质的表达量
对组织样本进行裂解、酶解、TMT标记（TMT10plex或TMTpro16plex），分级后进行LC-MS/MS分析。
节律性分析
识别具有昼夜节律的蛋白质（周期因子）
使用MetaCycle包对T12至T46时间段的蛋白质组数据进行节律性分析，以确定蛋白质周期因子。
差异蛋白与通路分析
比较WT和DKO小鼠蛋白质组差异及富集通路
通过t检验和Ingenuity Pathway Analysis (IPA)鉴定差异表达蛋白及富集通路。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 行为监测 | ClockLab | Actimetrics | -- |
| 组织采样 | 脑模具 | Shenzhen RWD Life Science Co, Ltd | 68707 |
| 组织打孔器 | Integra Miltex | -- | |
| 蛋白质印迹 | PVDF膜 | -- | -- |
| 抗肌动蛋白抗体 | Sigma | A5441 | |
| 抗CLOCK抗体 | CST | 5157S | |
| 抗PER1抗体 | MBL | PM091 | |
| 抗PER2抗体 | MBL | PM083 | |
| 山羊抗小鼠IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| 山羊抗兔IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2004 | |
| 多功能成像系统 | Clinx | -- | |
| 蛋白质组学样本制备 | 尿素 | Sigma | -- |
| 蛋白酶抑制剂片剂 | Roche | -- | |
| 组织研磨器 | Analytik-Jena AG | -- | |
| 三(2-羧乙基)膦 | Sigma | -- | |
| Lys-C | Hualishi Tech. Ltd | -- | |
| 胰蛋白酶 | Hualishi Tech. Ltd | -- | |
| SOLAμ固相萃取板 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质组学标记 | TMT 10plex | Thermo Fisher Scientific | -- |
| TMTpro 16plex | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质组学分级 | 赛默飞Ultimate Dionex 3000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| XBridge Peptide BEH C18色谱柱 | Waters | -- | |
| 蛋白质组学质谱分析 | Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive HF | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA测序 | BGIseq500平台 | BGI-shenzhen | -- |
| 数据采集 | Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与饲养 | 小鼠品系（C57BL/6J）、年龄（6周龄）、性别（雄性）、饲养条件（12小时光/12小时暗同步至少1周） 阅读提示：见“Animals and Tissue Collection”部分。 |
| 组织采集 | 8种组织类型、时间点（T0-T46，每2小时）、样本数量、处理方式（戊巴比妥钠注射、PBS灌注） 阅读提示：见“Animals and Tissue Collection”部分。 |
| 蛋白质组学分析 | TMT标记类型（10plex或16plex）、LC-MS/MS参数、蛋白周期因子阈值 阅读提示：见“TMT-Based Proteomics Profiling”和“Rhythmicity Analysis Using Metacycle”部分。 |
| 节律性分析 | MetaCycle参数（最小周期23.1，最大周期24.9，默认周期23.7）、时间段（T12-T46）、rAMP阈值（≥0.1） 阅读提示：见“Rhythmicity Analysis Using Metacycle”部分。 |