TNBS诱导大鼠结肠炎模型建立及HSC治疗
评估HSC对TNBS诱导的结肠炎的改善作用
雄性SD大鼠直肠给予TNBS（80 mg/kg）诱导结肠炎，24小时后腹腔注射HSC（0.625、1.25、2.5 mg/kg，每日两次）或灌胃美沙拉嗪（200 mg/kg，每日一次）连续7天，评估体重、疾病活动指数、结肠长度和重量。
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常春藤皂苷C通过调节S100A9/MAPK和中性粒细胞募集失活恢复受损的肠道屏障从而改善结肠炎
Hederacoside C ameliorates colitis via restoring impaired intestinal barrier through moderating S100A9/MAPK and neutrophil recruitment inactivation.
实验完整度
高包含体内动物模型（TNBS诱导大鼠结肠炎）、体外细胞实验（Caco-2、HEK293T）、定量蛋白质组学、免疫共沉淀、功能验证（增殖、凋亡、屏障功能）及机制验证（S100A9/MAPK/NF-κB通路）。
主要模型
TNBS诱导的Sprague-Dawley大鼠结肠炎模型 人结肠腺癌Caco-2细胞 HEK293T细胞（用于TLR4二聚化研究） 小鼠骨髓中性粒细胞
重点核对
TNBS剂量：80 mg/kg，直肠给药 HSC给药剂量：0.625、1.25、2.5 mg/kg，腹腔注射，每日两次，连续7天 美沙拉嗪给药剂量：200 mg/kg，灌胃，每日一次，连续7天 LPS刺激浓度：1 μg/mL 重组S100A9蛋白浓度：1 μg/mL
摘要
常春藤皂苷C（HSC）作为一种新型的炎症调节剂备受关注，但其抗炎机制仍不清楚。在本研究中，我们研究了HSC在体内和体外如何减轻肠道炎症。HSC注射可显著减轻TNBS诱导的结肠炎，其机制是抑制促炎细胞因子的产生和结肠上皮细胞凋亡，并部分恢复结肠上皮细胞增殖。HSC注射的治疗效果与口服美沙拉嗪（200 mg·kg−1·d−1，灌胃）相当。在脂多糖刺激的人肠道上皮Caco-2细胞中，HSC（0.1、1、10 μM）预处理显著抑制MAPK/NF-κB及其下游信号通路的激活。预处理HSC可阻止LPS诱导的TLR4二聚化和MyD88募集。定量蛋白质组学分析显示，HSC注射调节了结肠样本中的18种蛋白质，主要聚集在中性粒细胞脱颗粒。其中，参与中性粒细胞脱颗粒的S100A9是下调最显著的蛋白质之一。HSC抑制了S100A9及其下游基因（包括TLR4、MAPK和NF-κB轴）在结肠中的表达。在Caco-2细胞中，重组S100A9蛋白激活MAPK/NF-κB信号通路并诱导炎症，而HSC预处理可改善这些效应。值得注意的是，HSC在体外和体内均减弱了中性粒细胞的募集和脱颗粒以及S100A9的释放。此外，HSC通过抑制S100A9促进紧密连接蛋白的表达并修复上皮屏障。我们的结果证实，HSC通过调节S100A9/MAPK和中性粒细胞募集失活恢复受损的肠道屏障从而改善结肠炎，表明HSC是治疗结肠炎的有前途的候选药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HSC如何通过调节S100A9/MAPK信号通路和中性粒细胞募集来改善结肠炎？
- 核心机制
- HSC通过抑制S100A9的表达和释放，进而抑制MAPK/NF-κB信号通路，减少中性粒细胞募集和脱颗粒，恢复肠道上皮屏障功能。
- 主要证据
- TNBS诱导的结肠炎大鼠模型中，HSC减轻炎症、恢复肠屏障；体外实验中HSC抑制LPS诱导的TLR4二聚化和MyD88募集，抑制MAPK/NF-κB通路，调节S100A9及其下游信号；重组S100A9蛋白激活通路，HSC可逆转其效应。
- 研究意义
- 研究结果表明HSC可能成为治疗结肠炎的潜在药物，为炎症性肠病治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测炎症细胞因子和趋化因子
验证HSC对炎症反应的抑制作用
ELISA和RT-PCR检测结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、CXCL-1、CXCL-2、CXCL-5的水平。
评估肠上皮细胞增殖和凋亡
评估HSC对TNBS诱导的肠上皮细胞增殖抑制和凋亡的影响
通过EdU染色检测细胞增殖，TUNEL染色检测细胞凋亡，Western blot检测凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、p53、cleaved-caspase 3）的表达。
体外验证HSC对MAPK/NF-κB信号通路的抑制
验证HSC对LPS诱导的炎症信号通路的抑制
Caco-2细胞用HSC预处理1小时，然后LPS刺激2小时，Western blot检测p-JNK、p-ERK、p-p38、p-p65蛋白水平，ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-1β释放。
检测TLR4二聚化和MyD88募集
验证HSC对LPS诱导的TLR4激活的抑制
HEK293T细胞共转染Flag-TLR4和HA-TLR4质粒，HSC预处理后LPS刺激，免疫共沉淀和Western blot检测TLR4二聚体和MyD88结合。
定量蛋白质组学分析
鉴定HSC调节的差异表达蛋白并分析生物学过程
用无标记定量蛋白质组学分析TNBS模型组和HSC治疗组的结肠组织，鉴定差异表达蛋白，并用Metascape数据库分析生物学过程。
验证S100A9及其下游信号通路
验证S100A9在HSC抗炎机制中的作用
Western blot检测结肠组织中S100A9、TLR4、p-JNK、p-ERK、p-p38、p-p65水平；Caco-2细胞用重组S100A9蛋白刺激，检测MAPK/NF-κB通路激活及炎症因子释放，并观察HSC的抑制效应。
评估中性粒细胞募集和脱颗粒
验证HSC对中性粒细胞募集和激活的抑制作用
免疫组化检测结肠中Ly6G阳性细胞，ELISA检测MPO水平，免疫荧光检测CD11b和S100A9共定位；体外分离小鼠骨髓中性粒细胞，用fMLP诱导脱颗粒，检测弹性蛋白酶、MMP-9和S100A9释放。
评估肠道屏障功能恢复
验证HSC通过抑制S100A9恢复肠道屏障功能
Evans blue测定结肠通透性，Western blot和免疫组化检测紧密连接蛋白（ZO-1、claudin-1、occludin）表达，并利用中性粒细胞上清和S100A9过表达实验验证S100A9的介导作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物治疗 | 美沙拉嗪 | Ethypharm Pharmaceutical Co., Ltd. | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11995065 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270106 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 10378016 | |
| 药物处理 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L6529 |
| 重组S100A9蛋白 | Abcam | ab95909 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Ambion | -- |
| RT-PCR | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Scientific | -- |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| Advanced™ Universal SYBR® Green | Bio-Rad | -- | |
| CFX96™实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| HRP底物 | Millipore Corporation | -- | |
| ChemiDoc XRS成像仪 | Bio-Rad | -- | |
| ImageJ软件 | -- | -- | |
| TLR4二聚化实验 | 蛋白A/G磁珠试剂盒 | -- | -- |
| 免疫荧光 | FITC抗CD11b抗体 | Thermo Fisher | CD11B01 |
| FITC抗S100A9抗体 | Cell Signaling Technology | 73425S | |
| 二抗 (GB22302) | Solarbio | GB22302 | |
| 蛋白质组学 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- |
| 胰蛋白酶 | TaKaRa Bio | -- | |
| C18 Zip-tips | Merck Millipore | -- | |
| Orbitrap Fusion Lumos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MaxQuant软件 | -- | -- | |
| 中性粒细胞分离 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| PE-Ly6G抗体 | BioLegend | 127608 | |
| CD11b抗体 | BioLegend | 101212 | |
| BD FACSVerse™流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 中性粒细胞激活 | fMLP（N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸） | Sigma Aldrich | F3506-10MG |
| 中性粒细胞脱颗粒检测 | ELISA试剂盒（用于弹性蛋白酶、MMP9、S100A9） | Lvye Biotechnology | -- |
| 免疫组化 | Ly6G抗体 | Biorbyt | orb322983 |
| ZO-1抗体 | Signalway Antibody | 29274 | |
| Occludin抗体 | Proteintech | 27260-1-AP | |
| Claudin-1抗体 | Proteintech | 28674-1-AP | |
| 二抗 | Beyotime | A0192 | |
| 肠道通透性测定 | 伊文思蓝 | -- | -- |
| 细胞增殖检测 | BeyoClick™ EdU-488试剂盒 | Beyotime | -- |
| 凋亡检测 | 原位细胞死亡检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| 显微镜 | 共聚焦激光扫描显微镜 (LSM 710) | ZEISS | -- |
| 光学显微镜 | Olympus | CX31 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | TNBS剂量、给药途径、溶剂、禁食时间 阅读提示：Methods: TNBS-induced colitis |
| 药物处理 | HSC给药剂量、频率、途径、持续时间；美沙拉嗪给药剂量、途径、频率 阅读提示：Methods: HSC administration |
| 细胞实验 | 细胞系、培养基、血清浓度、HSC预处理浓度和时间、LPS或重组S100A9刺激浓度和时间 阅读提示：Methods: Cell culture and drug preparation |
| 中性粒细胞实验 | 中性粒细胞来源、分离方法、fMLP浓度和处理时间、HSC预处理浓度 阅读提示：Methods: Neutrophil purification and activation assays |
| 蛋白质组学 | 样本量、蛋白提取方法、酶解条件、质谱参数、数据筛选标准 阅读提示：Methods: Label-free quantitative proteomics analysis |