尿液蛋白质组学筛选
鉴定在肺癌患者和模型小鼠中异常表达的尿液蛋白
使用DIA质谱比较肺癌患者与健康对照的尿液蛋白质组，同时比较肺癌模型小鼠与野生型小鼠
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尿苹果酸脱氢酶2是早期检测非小细胞肺癌的新生物标志物
Urinary malate dehydrogenase 2 is a new biomarker for early detection of non-small-cell lung cancer.
实验完整度
高包括尿液蛋白质组学筛选、ELISA大样本验证、组织表达分析及细胞功能实验等多个独立证据层级
主要模型
尿液样本队列（含1091例NSCLC患者和736例健康对照） 肺癌模型小鼠（EGFRL858R、EGFR19DEL驱动） 肺癌细胞系（A549、HOP-62、PC-9） 肺癌组织样本（包括19对配对组织及197例FFPE组织）
重点核对
尿液样本采集、处理及蛋白提取方法 ELISA检测的cut-off值（9.523 ng/100 µg）及灵敏度/特异性 MDH2敲低效率（A549、HOP-62、PC-9分别降低6.3、6.9、5.3倍） 细胞增殖实验中的细胞密度（1000细胞/孔）及多西环素诱导浓度（1 μg/mL）
摘要
可靠且无创的生物标志物用于非小细胞肺癌（NSCLC）的早期诊断是未满足的需求。本研究旨在筛选并验证用于NSCLC早期诊断的潜在尿液生物标志物。通过蛋白质质谱分析，发现与对照组相比，肺癌患者和肺癌模型小鼠的尿液MDH2含量均丰富。采用ELISA测量了包括1091例NSCLC患者和736例健康对照在内的回顾性和前瞻性队列的尿液样本。与健康对照相比，I期NSCLC患者的尿液MDH2水平较高。在回顾性和前瞻性队列中，尿液MDH2区分I期病例与对照的受试者工作特征曲线下面积（AUC）分别为0.7679和0.7234。尿液MDH2水平与性别和吸烟史相关。肺癌组织中MDH2表达水平升高。使用shRNA敲低MDH2可抑制肺癌细胞的增殖。我们的研究表明，早期NSCLC患者的尿液MDH2浓度高于对照组，且MDH2可作为NSCLC早期检测的潜在生物标志物。
苹果酸脱氢酶2在NSCLC患者的尿液和癌组织中均显著升高。尿液中MDH2的水平可作为NSCLC早期诊断的辅助生物标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 尿液MDH2是否可作为非小细胞肺癌早期诊断的潜在生物标志物？
- 核心机制
- MDH2可能通过影响能量代谢促进肿瘤发生，敲低MDH2抑制肺癌细胞增殖
- 主要证据
- 尿液蛋白质质谱筛选及ELISA验证显示I期NSCLC患者尿液MDH2水平显著升高，AUC达0.72-0.77；肺癌组织MDH2表达升高；MDH2敲低降低细胞增殖和克隆形成能力
- 研究意义
- 尿液MDH2作为非侵袭性、易获取的生物标志物，可能有助于改善NSCLC的早期检测和筛查
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ELISA大样本验证
验证候选生物标志物在大型队列中的诊断性能
使用ELISA检测回顾性和前瞻性队列尿液样本中MDH2浓度，并进行ROC分析
组织表达分析
验证MDH2在肺癌组织中的表达水平
通过qPCR、Western blot和免疫组化检测肺癌组织及正常组织中MDH2表达
细胞功能验证
探讨MDH2对肺癌细胞增殖的影响
使用多西环素诱导的MDH2敲低肺癌细胞系进行细胞增殖和克隆形成实验
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
蛋白质组学分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质组学分析 | Orbitrap Fusion Lumos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY-nLC 1200高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Acclaim PepMap 100 C18色谱柱 | Thermo Fisher Scientific | P/N:164564 | |
| iRT标准品 | Biognosys | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| ELISA | MDH2 ELISA试剂盒 | Signalway Antibody | EK1911 |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Ambion | Lot |
| PrimeScript II逆转录酶 | Takara | Lot | |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | Lot | |
| CFX96实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MDH2一抗 | Abcam | Lot | |
| 二抗 | Ray Antibody | Lot | |
| ECL Prime化学发光检测试剂 | -- | -- | |
| C DIGIT化学发光扫描仪 | LI-COR | -- | |
| 免疫组化 | DAB底物 | Origene | -- |
| 细胞增殖实验 | CCK8试剂 | DOJINDO Laboratories | Lot |
| 构建细胞系 | Tet-pLKO-zeo载体 | -- | -- |
| 博来霉素 | -- | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 尿液样本处理 | 硝酸纤维素膜 | Millipore | -- |
| 动物实验 | CT扫描仪 | PINGSENG Healthcare | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 尿液样本收集与处理 | 样本采集量（20-30 mL）、离心条件（5000 g，40 min，4°C）、储存条件（-80°C或硝化纤维素膜固定） 阅读提示：Materials and Methods 2.4 Preparation of urine samples |
| ELISA检测 | 每孔加样量（100 µg尿蛋白）、检测波长（450 nm）、cut-off值（9.523 ng/100 µg） 阅读提示：Materials and Methods 2.8 Enzyme-linked immunosorbent assay；Results 3.2 |
| 细胞培养及建立敲低细胞系 | 细胞系（A549、HOP-62、PC-9）、培养基（RPMI 1640+10%FBS）、筛选浓度（zeomycin 300 μg/mL，1周） 阅读提示：Materials and Methods 2.2 Cell culture and reagents；2.3 Plasmids and lentivirus packaging |
| 细胞功能实验 | 多西环素浓度（1 μg/mL）、细胞增殖实验细胞数（1000细胞/孔）、克隆形成实验细胞数（200细胞/孔，培养7天） 阅读提示：Materials and Methods 2.12 Cell proliferation assay；2.13 Colony-forming assay；Figure legends 4 |
| 动物实验 | 小鼠品系（C57BL6背景）、月龄（6-8周）、喂养时间（约2个月Dox饮食） 阅读提示：Materials and Methods 2.14 Mice |