检测IL-37在KD患者血清中的水平及其在ECs中的表达变化
初步确认IL-37是否参与KD的病理过程，并识别关键的IL-37亚型。
收集KD患者和健康对照的血清，用ELISA检测IL-37水平；用qRT-PCR和western blot检测KD血清处理的HUVECs中IL-37各亚型（IL-37a-e）的表达。
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IL-37b通过IL-1R8通路减轻川崎病中的内皮细胞凋亡和炎症
IL-37b alleviates endothelial cell apoptosis and inflammation in Kawasaki disease through IL-1R8 pathway.
实验完整度
高包含KD患者血清样本检测、体外细胞实验（HUVECs和THP1共培养）、体内小鼠模型（CAWS诱导的KD模型）以及机制验证（siRNA敲低IL-1R8，检测ERK/NFκB通路）等多个独立证据层级。
主要模型
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与THP1细胞共培养模型 CAWS诱导的KD小鼠模型 KD患者血清样本
重点核对
IL-37b处理浓度：100 ng/ml IL-37b给药剂量：40 μg/kg体重，腹腔注射 CAWS剂量：4 mg/只，腹腔注射连续5天 IL-1R8 siRNA敲低验证 AAV9-IL-1R8 siRNA体内敲低验证
摘要
川崎病（KD）是一种儿科人群的急性血管炎，若不治疗可能发展为冠状动脉瘤。它被认为是发达国家儿童获得性心脏病的主要原因。白细胞介素（IL）-37，作为IL-1家族成员之一，是先天性和适应性免疫激活引起的炎症的天然抑制因子。然而，IL-37在KD中的详细作用尚不清楚。KD患者的血清显示，与健康对照（HCs）相比，IL-37水平显著降低。QRT-PCR和蛋白质印迹分析显示，在KD血清处理的THP1细胞培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，IL-37变体IL-37b的表达水平显著下调。因此，我们研究了IL-37b在KD背景下的作用，并假设IL-37b可能在KD患者中具有强大的保护作用。我们首先观察并证实了IL-37b在白色念珠菌细胞壁提取物（CAWS）诱导的KD小鼠模型中的保护作用。体外实验表明，IL-37b通过抑制ERK和NFκB激活，经由IL-1R8受体减轻内皮细胞凋亡和炎症，这也在KD小鼠模型中得到再现。总之，我们的研究结果表明，IL-37b在KD冠状动脉内皮损伤中发挥有效的保护作用，为IL-37b作为治疗KD的潜在候选药物提供了新的证据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IL-37b在川崎病（KD）中对血管内皮细胞凋亡和炎症的作用及其机制尚不清楚，本研究旨在探讨IL-37b在KD中的保护作用及其潜在机制。
- 核心机制
- IL-37b通过IL-1R8受体抑制ERK和NFκB的激活，从而减轻内皮细胞凋亡和炎症，保护冠状动脉内皮损伤。
- 主要证据
- 体外实验显示IL-37b抑制KD血清处理的ECs凋亡和炎症，且这种作用依赖于IL-1R8；体内KD小鼠模型中，IL-37b减轻冠状动脉炎症和内皮细胞凋亡，而IL-1R8敲低逆转了IL-37b的保护作用，同时观察到ERK和NFκB磷酸化水平下降。
- 研究意义
- 研究表明IL-37b是KD的潜在候选治疗药物，为KD冠状动脉内皮损伤提供了新的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估重组人IL-37b对KD小鼠模型冠状动脉损伤的保护作用
在体内验证IL-37b对KD小鼠冠状动脉炎症的缓解作用。
使用CAWS诱导KD小鼠模型，腹腔注射重组人IL-37b，通过H&E染色评估冠状动脉炎症，IHC检测VCAM-1、F4/80和中性粒细胞标记物，qRT-PCR检测炎症因子表达。
体外实验验证IL-37b对KD血清诱导的内皮细胞凋亡和炎症的影响
验证IL-37b在体外对KD血清诱导的ECs损伤的保护作用。
建立KD血清处理的THP1细胞与HUVECs共培养体系，预先用不同浓度IL-37b处理HUVECs，CCK8检测细胞活力，TUNEL染色和western blot检测凋亡标志物（BAX/Bcl-2），qRT-PCR和ELISA检测炎症因子表达。
验证IL-1R8在IL-37b抑制内皮细胞凋亡和炎症中的作用
确定IL-37b的作用是否依赖于IL-1R8受体。
检测IL-1R8在mRNA和蛋白水平的表达，并观察细胞表面和胞内IL-1R8表达；通过siRNA敲低IL-1R8，检测IL-37b对细胞凋亡和炎症因子表达的抑制作用是否被逆转。
探索IL-37b对ERK和NFκB信号通路的影响
阐明IL-37b调控内皮细胞凋亡和炎症的下游信号机制。
用western blot检测ERK、JNK、p38和NFκB p65的磷酸化水平；免疫荧光检测NFκB p65的核转位；在IL-1R8敲低后检测ERK和NFκB p65的磷酸化。
体内验证IL-37b对KD小鼠模型内皮细胞凋亡和炎症的缓解作用
在动物水平证实IL-37b对冠状动脉内皮损伤的保护作用。
在KD小鼠模型中，评估IL-37b对凋亡相关蛋白（BAX/Bcl-2）、内皮细胞凋亡（TUNEL/CD31双染）、炎症因子表达（TNF-α、IL-18）和ERK/NFκB激活的影响。
通过AAV9介导的IL-1R8敲低验证其体内作用
进一步证实IL-37b的保护作用依赖于IL-1R8。
在KD小鼠模型中给予AAV9-IL-1R8 siRNA，检测冠状动脉炎症、内皮细胞凋亡和炎症因子表达的变化，以及ERK和NFκB磷酸化水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| ELISA检测 | 人IL-37 ELISA试剂盒 | Solarbio | -- |
| RNA提取和反转录 | Trizol试剂 | -- | -- |
| 反转录 | PrimeScript™ RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | -- |
| 实时荧光定量PCR | Power TB green PCR预混液 | Takara | -- |
| Applied Biosystems QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统 | ThermoFisher | -- | |
| 蛋白质印迹分析 | 抗IL-37抗体 | Proteintech | 60296-1-lg |
| 抗IL-1R8抗体 | Proteintech | 27828-1-AP | |
| 抗ATP1A1抗体 | Proteintech | 14418-1-AP | |
| 抗磷酸化ERK抗体 | Affinity Biosciences | AF1015 | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | Affinity Biosciences | AF3318 | |
| 抗磷酸化p38抗体 | Affinity Biosciences | AF4001 | |
| 抗磷酸化NFkB p65抗体 | Affinity Biosciences | AF2006 | |
| 抗BAX抗体 | Signalway Antibody | 40635 | |
| 抗Bcl-2抗体 | Signalway Antibody | 40639 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-lg | |
| 细胞培养和药物处理 | 重组人IL-37b蛋白 | R&D Systems | -- |
| 细胞培养 | 人脐静脉内皮细胞 | ATCC | -- |
| THP1细胞 | ATCC | -- | |
| 免疫荧光染色 | Alexa Fluor 647二抗 | Abcam | -- |
| Alexa Fluor 488二抗 | Abcam | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 免疫荧光成像 | 共聚焦激光显微镜 | Nikon | -- |
| 蛋白质印迹分析 | ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad Laboratories | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| KD患者血清IL-37水平检测 | 样本来源：KD患者和健康对照（n分别为18和17），血清采集和储存条件（−80°C，4小时内） 阅读提示：Materials and methods: Patients’ blood sample and ethical consideration; Enzyme-linked immunosorbent assay |
| 体外细胞培养与处理 | HUVECs和THP1细胞系来源（ATCC）；共培养体系（上室THP1，下室HUVECs）；处理：KD或HC血清处理THP1细胞24小时；IL-37b预处理浓度100 ng/ml，处理时间1小时；培养基DMEM 阅读提示：Materials and methods: Cells culture and treatment; Fig. 3 legend |
| 动物模型建立与给药 | 小鼠品系、年龄、性别（C57BL/6，3-4周龄，雄性）；CAWS制备方法；CAWS剂量（4 mg/只），给药途径（腹腔注射），给药频率（每天一次，连续5天）；IL-37b剂量（40 μg/kg体重），给药时间（CAWS前2天和CAWS后），给药途径（腹腔注射）；分组（PBS, CAWS, CAWS+IL-37b, CAWS+IL-37b+AAV9-IL-1R8 siRNA） 阅读提示：Materials and methods: Preparation of CAWS; Animals and experimental design |
| IL-1R8沉默实验 | siRNA序列或来源；转染方法；AAV9-IL-1R8 siRNA的构建和注射方式；敲低效率验证（mRNA和蛋白水平） 阅读提示：Materials and methods: Western blot analysis; Fig. 4 and Fig. 7 legends |
| 信号通路检测 | 检测ERK、JNK、p38、NFκB p65磷酸化的抗体和稀释比例；NFκB p65核转位检测方法；样本处理（细胞或组织） 阅读提示：Materials and methods: Western blot analysis; Immunofluorescence staining; Fig. 5 and Fig. 6 legends |