转录组测序与差异表达基因鉴定
鉴定裸鼹鼠肌肉在急性缺氧应激下的差异表达基因
构建缺氧处理（1h、4h、8h、12h）和对照的cDNA文库，进行RNA-seq测序，比对到裸鼹鼠基因组，并使用DEseq2鉴定差异表达基因。
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裸鼹鼠（Heterocephalus glaber）的转录组测序及耐缺氧基因的鉴定
Transcriptome sequencing of the naked mole rat (Heterocephalus glaber) and identification of hypoxia tolerance genes.
实验完整度
高包含转录组测序、qRT-PCR和Western blot验证，以及siRNA敲低后的细胞功能实验，涵盖表达验证和功能机制验证。
主要模型
裸鼹鼠（NMR）动物模型 裸鼹鼠肌肉组织 裸鼹鼠肌肉成纤维细胞
重点核对
缺氧处理为5% O2，时间点包括1h、4h、8h和12h，并设置对照（21% O2） 两个处理组和对照组均设置了两个生物学重复 siRNA敲低STMN1、MAPK8IP1和MAPK10后，分别检测细胞增殖、凋亡和细胞周期变化 使用GAPDH和β-actin作为内参验证qRT-PCR和Western blot结果
摘要
裸鼹鼠（NMR；Heterocephalus glaber）是一种分布于肯尼亚、埃塞俄比亚和索马里地区的小型啮齿动物。它对缺氧具有高度耐受性，因此被认为是研究耐缺氧机制最重要的天然模型之一。裸鼹鼠耐缺氧的各种机制开始在组织的不同水平上被理解，下一代测序方法有望将这种理解扩展到基因表达水平。在本研究中，我们使用 Illumina HiSeq 2500 系统检测了暴露于缺氧的裸鼹鼠肌肉转录组的序列和转录本丰度数据，以阐明对地下缺氧环境的可能基因组适应性反应。将 RNA-seq 原始 FastQ 数据比对到裸鼹鼠基因组。通过比较缺氧组和对照组，我们鉴定出 2337 个差异表达基因（DEG）。通过基因本体论（GO）分析对 DEG 进行功能注释，揭示了缺氧应激相关的 GO 类别富集，包括“生物调节”、“细胞过程”、“离子转运”和“细胞-细胞信号传导”。针对京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库分析了 DEG 在信号通路中的富集，以鉴定 DEG 之间可能的相互作用。结果显示，DEG 在黏着斑、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路中显著富集。此外，抑制 DEG（STMN1、MAPK8IP1 和 MAPK10）的表达可在缺氧后诱导裸鼹鼠成纤维细胞凋亡并阻滞细胞生长。因此，这项对裸鼹鼠的全局转录组分析可以为研究哺乳动物耐缺氧提供重要的遗传资源。此外，鉴定出的 DEG 可能为中风和心血管疾病治疗策略的生物医学研究提供重要的分子靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 裸鼹鼠应对急性缺氧应激的转录组变化及其耐缺氧的潜在遗传机制是什么？
- 核心机制
- MAPK信号通路（涉及STMN1、MAPK8IP1和MAPK10）在缺氧条件下被激活，通过调节细胞增殖、凋亡和细胞周期来促进细胞存活。
- 主要证据
- 转录组测序鉴定出2337个差异表达基因，qRT-PCR和Western blot验证了STMN1、MAPK8IP1和MAPK10的表达上调；siRNA敲低这些基因导致成纤维细胞增殖受抑、凋亡增加和细胞周期阻滞。
- 研究意义
- 为研究哺乳动物耐缺氧提供了遗传资源，并为缺血性疾病（如中风和心血管疾病）的治疗策略提供了潜在分子靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异表达基因的功能富集分析
揭示差异表达基因涉及的生物学过程和信号通路
使用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行功能注释和通路富集分析。
候选基因表达验证
验证RNA-seq结果中候选基因的表达模式
通过qRT-PCR和Western blot检测STMN1、MAPK8IP1和MAPK10在肌肉组织和缺氧处理的成纤维细胞中的表达。
siRNA介导的基因敲低及功能分析
探究STMN1、MAPK8IP1和MAPK10在缺氧条件下对细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响
使用siRNA敲低STMN1、MAPK8IP1和MAPK10表达后，检测细胞增殖、凋亡和细胞周期变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因功能注释
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 转录组测序 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Illumina mRNA-Seq建库试剂盒 | Illumina | -- | |
| Illumina HiSeq 2500测序平台 | Illumina | -- | |
| qRT-PCR | TIANScript cDNA第一链合成试剂盒 | Tiangen | -- |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR检测系统 | Applied Biosystems | -- | |
| SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Wuhan Boster Biotech | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| STMN1抗体 | Proteintech | -- | |
| MAPK8IP1抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| MAPK10抗体 | Abcam | -- | |
| 山羊抗兔IgG抗体 | -- | -- | |
| 抗β-actin抗体 | Wuhan Boster Biotech | -- | |
| Kodak Gel Logic 4000 R成像系统 | Carestream | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| siRNA转染 | 脂质体2000 | Invitrogen | -- |
| 细胞增殖检测 | 细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒 | Signalway Antibody | -- |
| Synergy HT酶标仪 | Bio-Tek | -- | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-异硫氰酸荧光素 | -- | -- |
| 碘化丙啶 | Nanjing KGI biotechnology | -- | |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型及缺氧处理 | 实验动物为成年裸鼹鼠（8个月龄，体重40-60g），缺氧处理为5% O2，时间点包括1h、4h、8h和12h；对照组为21% O2；每个处理两个生物学重复 阅读提示：Materials and Methods, Animals and hypoxic conditions |
| 转录组测序 | RNA提取使用TRIzol试剂，cDNA文库构建使用Illumina mRNA-Seq Prep Kit，测序平台为Illumina HiSeq 2500，读长125-bp paired-end 阅读提示：Materials and Methods, Extraction of total RNA and sequencing |
| 差异表达基因鉴定 | 使用STAR比对到NMR基因组，DEseq2鉴定DEGs，比较缺氧组与对照组（1h vs 0h, 4h vs 0h, 8h vs 0h, 12h vs 0h） 阅读提示：Materials and Methods, Gene expression and functional analysis of DEGs |
| qRT-PCR验证 | 使用500 ng总RNA进行cDNA合成，使用StepOnePlus实时PCR系统，SYBR Green Master Mix，内参为GAPDH，采用ΔΔCt法计算相对表达量 阅读提示：Materials and Methods, Validation of expression of genes involved in MAPK signaling pathway by real-time PCR |
| Western blot验证 | 使用RIPA裂解液提取蛋白，一抗浓度1:1000（STMN1, MAPK8IP1, MAPK10），内参为β-actin（浓度1:2000），二抗浓度1:4000 阅读提示：Materials and Methods, Western blot analysis |
| 细胞培养及缺氧处理 | 原代成纤维细胞来源于NMR肌肉组织，培养在含15% FBS的DMEM中，缺氧条件为5% O2, 5% CO2, 90% N2 阅读提示：Materials and Methods, Cell culture and hypoxic stress |
| siRNA敲低及功能检测 | siRNA转染浓度50 nM，转染时间24h（mRNA检测）和48h（蛋白检测），使用lipofectamine 2000转染；细胞增殖检测于24h、48h、72h进行；凋亡检测使用Annexin-V-FITC和PI染色；细胞周期分析使用PI染色 阅读提示：Materials and Methods, Small interfering RNA-mediated inhibition of gene expression; Cell proliferation assay; Analysis of apoptotic level; Cell cycle analysis |