构建并表征PGRN-R504X敲入小鼠模型
建立更接近人类PGRN突变相关FTLD病理的动物模型
通过基因打靶在C57BL/6J ES细胞中引入R504X突变，生成杂合敲入小鼠，并通过免疫组化、Western blot等验证TDP43病理、PGRN表达降低及行为表型。
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靶向Tyro3通过tau介导的突触病理改善PGRN突变FTLD-TDP模型
Targeting Tyro3 ameliorates a model of PGRN-mutant FTLD-TDP via tau-mediated synaptic pathology.
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内动物模型、磷酸化蛋白质组学、行为学、双光子成像及人脑样本验证等多层级证据，含功能验证与机制验证。
主要模型
PGRN-R504X敲入小鼠(PGRN-KI) 小鼠原代皮层神经元 COS7细胞 人FTLD-TDP尸检脑组织
重点核对
PGRN-KI小鼠为杂合子，携带R504X突变，C57BL/6J背景 vemurafenib口服剂量32 mg/kg/天，给药6至12周 Gö6976浓度4.4 μM，渗透泵颅内注射速率0.15 μl/h，给药10至12周 行为学测试包括Morris水迷宫和恐惧条件化，评估%目标区域停留时间和目标穿越次数 tau Ser203磷酸化从4周龄开始升高，TDP43聚集从24周龄开始
摘要
Progranulin (PGRN)基因的突变导致tau病理阴性、TDP43病理阳性的额颞叶变性(FTLD-TDP)。我们构建了携带R504X突变的敲入小鼠(PGRN-KI)。对该模型的磷酸化蛋白质组学分析揭示了在TDP43聚集和认知障碍之前，连接PKC和MAPK到tau的信号通路被激活，并确定PKCα是早期tau在Ser203位点磷酸化的激酶。由于PGRN减少导致的Gas6与Tyro3结合的抑制解除，通过PLCγ激活PKCα，诱导tau在Ser203位点的磷酸化，tau错误定位到树突棘，并导致棘丢失。给予PKC抑制剂、B-Raf抑制剂或敲低Gas6-Tyro3-tau轴中的分子可挽救PGRN-KI小鼠的棘丢失和认知障碍。总之，这些结果表明靶向早期且不依赖聚集的tau信号代表了一种有前景的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在PGRN突变导致的FTLD-TDP中，TDP43聚集之前是否存在早期分子事件驱动突触病理和认知障碍？
- 核心机制
- PGRN减少导致其对Gas6与Tyro3结合的抑制作用解除，激活Tyro3-PLCγ-PKCα通路，磷酸化tau Ser203，导致tau错误定位至树突棘并引起棘丢失。
- 主要证据
- PGRN-KI小鼠模型显示tau Ser203磷酸化在4周龄升高，早于TDP43聚集（24周龄）；SPR和pull-down证实PGRN抑制Gas6-Tyro3结合；PKC抑制剂、B-Raf抑制剂及敲低Gas6-Tyro3-tau轴分子可挽救棘丢失和认知障碍。
- 研究意义
- 靶向早期、不依赖TDP43聚集的tau信号通路可能为FTLD及AD提供治疗策略，PKC和B-Raf可作为药物靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
磷酸化蛋白质组学分析
鉴定PGRN-KI小鼠早期激活的信号通路
对大脑皮层进行磷酸化蛋白质组学分析，鉴定差异磷酸化位点，并通过KEGG通路富集分析发现MAPK、PKC等通路激活。
验证PGRN与Gas6-Tyro3相互作用
揭示PGRN减少导致信号激活的上游机制
通过SPR和pull-down实验证明PGRN直接结合Gas6并抑制Gas6与Tyro3的结合，而PGRN本身不结合Tyro3。
体外验证Gas6-Tyro3信号通路及tau磷酸化
验证PGRN对Gas6诱导的信号通路和tau磷酸化的抑制作用
在小鼠原代皮层神经元中，添加Gas6激活Tyro3及其下游信号，并观察PGRN的抑制作用；通过siRNA敲低Tyro3验证信号通路依赖性。
鉴定催化tau Ser203磷酸化的激酶
确定tau Ser203位点的上游激酶
利用KISS方法和体外/体内激酶实验，筛选并验证PKCα等激酶能直接磷酸化tau Ser203。
在体药理学抑制和基因敲低实验
验证Gas6-Tyro3信号在PGRN-KI小鼠中的功能影响
给予PGRN-KI小鼠B-Raf抑制剂vemurafenib或PKC抑制剂Gö6976，或用sh/siRNA敲低B-Raf、PKCα、Gas6、Tyro3、tau，评估对tau磷酸化、棘密度和认知行为的影响。
人源样本验证
验证在小鼠中发现的tau磷酸化位点错误定位是否存在于人类FTLD-TDP
对5例散发FTLD-TDP尸检脑组织进行免疫组化，检测Ser214磷酸化tau（对应小鼠Ser203）是否与PSD95共定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质检测 | 抗PGRN抗体 | R&D Systems | AF2557 |
| 抗PGRN抗体 | Calbiochem | ST1574 | |
| 抗磷酸化B-Raf抗体 | Abcam | ab124794 | |
| 抗磷酸化PKCγ抗体 | Abcam | ab5796 | |
| 抗磷酸化MEK-1抗体 | Millipore | 07-853 | |
| 抗MEK1抗体 | Abcam | ab32088 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling | 4370 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling | 9102 | |
| 抗磷酸化PKCα抗体 | NeoScientific | AP0560 | |
| 抗TRADD抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7868 | |
| 抗RIP1抗体 | R&D | MAB3585 | |
| 抗TRAF2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-877 | |
| 抗caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| 抗GAPDH抗体 | Millipore | MAB374 | |
| 免疫组化 | 抗NeuN抗体 | Millipore | MAB377B |
| 抗TDP43抗体 | Cell Signaling Technology | G400 | |
| 抗泛素抗体 | Cell Signaling Technology | P4D1 | |
| 抗磷酸化TDP43抗体 | Cosmo Bio | TIP-PTD-P02 | |
| 抗FUS抗体 | Abcam | ab84078 | |
| 抗p62抗体 | BD Bioscience | 610497 | |
| 抗IBA1抗体 | WAKO | 019-19741 | |
| Cy3偶联抗GFAP抗体 | Sigma-Aldrich | C9205 | |
| 抗CD4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13573 | |
| 抗B2M抗体 | Proteintech | 13511-1-AP | |
| 抗CD8抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7188 | |
| 抗γH2AX抗体 | Millipore | JBW301 | |
| 抗PHF-tau (AT-8) | Innogenetics | -- | |
| 抗磷酸化tau T231抗体 | Abcam | ab151559 | |
| 抗磷酸化tau S214抗体 | Abcam | ab170892 | |
| 抗PSD-95抗体 | Pierce | MA1-045 | |
| 磷酸化肽段富集 | Titansphere Phos-Tio试剂盒 | GL Sciences | -- |
| iTRAQ标记 | iTRAQ多重标记试剂盒 | AB SCIEX | -- |
| 质谱分析 | Triple TOF 5600系统 | AB SCIEX | -- |
| SPR分析 | Biacore T100 | GE Healthcare | -- |
| Fc-Tyro3重组蛋白 | SIGMA | D0315 | |
| Gas6重组蛋白 | R&D Systems | 885-GSB-050 | |
| 颗粒蛋白前体(PGRN) | R&D Systems | 2420-PG-050 | |
| 抗Fc抗体 | GE Healthcare | BR-1008-39 | |
| 抗Gas6抗体 | R&D | AF885-SP | |
| Pull-down实验 | His-PGRN重组蛋白 | R&D Systems | CF2420-PG-050 |
| His-BDNF重组蛋白 | MyBioSource | MBS962271 | |
| GST-Gas6重组蛋白 | Abnova | H00002621-P01 | |
| Ni-NTA琼脂糖 | Qiagen | 30210 | |
| 谷胱甘肽-琼脂糖 | GE Healthcare | 17075601 | |
| 药物处理 | 维莫非尼 | -- | -- |
| Gö6976 | Calbiochem | -- | |
| 基因敲低 | Tau-shRNA慢病毒颗粒 | Santa Cruz Biotechnology | sc-430402-V |
| 乱序shRNA慢病毒颗粒 | Santa Cruz Biotechnology | SC-108080 | |
| B-Raf shRNA慢病毒颗粒 | Santa Cruz Biotechnology | sc-63294-V | |
| Tyro3-siRNA慢病毒颗粒 | ABM | iV037848 | |
| PKCα-shRNA质粒 | OriGene | TG501653 | |
| Gas6-shRNA质粒 | Santa Cruz Biotechnology | sc-35451-SH | |
| in vivo-jetPEI转染试剂 | Polyplus-transfection | 201-10G | |
| 双光子成像 | AAV1-EGFP | -- | -- |
| FV1000MPE2激光扫描显微镜 | Olympus | -- | |
| MaiTaiHP DeepSee脉冲激光器 | Spectra Physics | -- | |
| IMARIS软件 | Bitplane | -- | |
| 行为学测试 | 渗透泵 | DURECT | 2006 |
| Western blot | Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| Immobilon-P PVDF膜 | Millipore | -- | |
| ECL Prime Western blot检测试剂 | GE Healthcare | RPN2232 | |
| ImageQuant LAS 500成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| 磷酸化蛋白质组学 | Sep-Pak Light C18柱 | Waters Corporation | -- |
| TSK gel SP-5PW柱 | TOSOH | -- | |
| Prominence UFLC系统 | Shimadzu | -- | |
| DiNa纳升液相色谱系统 | KYA Technologies Corporation | -- | |
| 质谱分析 | Analyst TF软件 | AB SCIEX | -- |
| ProteinPilot软件 | AB SCIEX | -- | |
| 细胞培养 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| COS7细胞 | ATCC | CRL-1651 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 模型构建 | PGRN R504X敲入小鼠为杂合子，C57BL/6J背景，通过CAC-Cre去除Neo cassette 阅读提示：Methods: Generation of PGRN R504X mutation-KI mice |
| 磷酸化蛋白质组学 | 样本量为每组3只，组织为大脑皮层，使用iTRAQ标记和Titansphere Phos-Tio Kit富集 阅读提示：Methods: Phosphoproteome analysis, 2D LC MS/MS analysis |
| SPR结合实验 | 使用Biacore T100，重组蛋白Gas6、PGRN、Fc-Tyro3浓度，预孵育条件（4°C或37°C，6小时） 阅读提示：Methods: Surface plasmon resonance |
| 体外细胞信号验证 | 原代皮层神经元培养天数（第7天），添加Gas6和PGRN的浓度范围，siRNA敲低Tyro3的条件 阅读提示：Methods: Cell culture and treatment, siRNA knockdown (需在补充材料中确认) |
| 药理学干预 | vemurafenib口服剂量32 mg/kg/天，给药时间6至12周；Gö6976浓度4.4 μM，渗透泵速率0.15 μl/h，给药时间10至12周 阅读提示：Results: Inhibition of Gas6-Tyro3 signals recues cognitive impairment, Methods: Rescue of spine morphology and behavioral analyses |
| 基因敲低 | sh/siRNA靶基因（tau, B-Raf, PKCα, Tyro3, Gas6），慢病毒或质粒浓度，注射位点（蛛网膜下腔），渗透泵速率0.15 μl/h，给药时间8至12周 阅读提示：Methods: Rescue of spine morphology and behavioral analyses |
| 行为学测试 | Morris水迷宫参数（平台位置、训练天数、探针测试）；恐惧条件化参数（白噪音65dB，足部电击0.4mA，2秒） 阅读提示：Methods: Behavioral analyses |
| 双光子成像 | AAV1-EGFP注射位点（RSD），成像区域（M2皮层第一层），成像时间点（0、8、24小时），分析方法（IMARIS） 阅读提示：Methods: Two-photon microscopic analysis of spine pathology |
| 人源样本验证 | 人类尸检样本N=5，免疫组化检测pSer214-tau和PSD95共定位，计数区域大小（40x40μm） 阅读提示：Results: pSer214-tau mislocalization in sporadic human FTLD-TDP |