RPL15亚细胞定位
确定RPL15在细胞中的定位及其与其他核仁蛋白的共定位关系。
通过免疫荧光染色观察RPL15与Bip、α-tubulin、nucleolin、fibrillarin、UBF的共定位，并计算Pearson相关系数；通过细胞核/浆分离和免疫印迹定量核内RPL15比例。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
核糖体蛋白L15参与结肠癌发生
Ribosomal Protein L15 is involved in Colon Carcinogenesis.
实验完整度
高包含免疫荧光、免疫印迹、蔗糖梯度离心、MTT、流式、Annexin V、组织样本IHC和临床相关性分析等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制探究。
主要模型
HeLa细胞（人宫颈癌细胞系） HCT116细胞（人结肠癌细胞系） RPE1细胞（人非转化上皮细胞系） 25对结肠癌组织及癌旁组织样本
重点核对
RPL15 siRNA序列（1#: 5'-UGGUGUUAACCAGCUAAAGdTdT-3'; 2#: 5'-UCCAGGAGCUAUGGAGAAAdTdT-3'） 细胞系：HeLa、HCT116、RPE1，培养条件（DMEM或DMEM:F-12加10% FBS，37°C，5% CO2） siRNA转染时间（24小时）及后续处理时间（48小时） RPL15表达检测：免疫印迹、免疫组化、实时PCR（使用β-actin标准化） 细胞周期分析：PI染色，流式检测至少5000细胞
摘要
核糖体生物发生负责所有真核细胞中的蛋白质合成。核糖体生物发生过程的扰动可导致蛋白质合成功能障碍及多种人类疾病。在本研究中，我们检测了RPL15（一种大核糖体亚基蛋白）在人类结肠癌发生中的作用。我们的结果显示，与配对的非癌组织和未转化上皮细胞相比，RPL15在人原发性结肠癌组织和培养细胞系中显著上调。结肠癌组织中RPL15表达升高与患者的临床病理特征密切相关。我们确定了RPL15对人细胞核仁维持、核糖体生物发生和细胞增殖的影响。我们发现RPL15是维持核仁结构和核仁中pre-60S亚基形成所必需的。RPL15的缺失导致核糖体应激，在未转化的人上皮细胞中引起G1-G1/S期细胞周期阻滞，但在结肠癌细胞中引起凋亡。总之，这些结果表明RPL15参与人类结肠癌发生，并可能成为结肠癌治疗的潜在临床生物标志物和/或靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RPL15在人类结肠癌发生中扮演何种角色？
- 核心机制
- RPL15对于维持核仁结构和形成pre-60S核糖体亚基至关重要，其缺失引起核糖体应激，导致未转化上皮细胞发生G1-G1/S期周期阻滞，而结肠癌细胞发生凋亡。
- 主要证据
- 在细胞系和组织样本中检测到RPL15过表达；免疫荧光显示RPL15定位于核仁；siRNA敲降导致核仁结构异常和pre-60S减少；HCT116细胞中诱导caspase 3活化和Annexin V阳性，RPE1细胞中引起细胞周期阻滞。
- 研究意义
- RPL15可能成为结肠癌治疗的潜在临床生物标志物和/或靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RPL15敲降对核仁结构的影响
验证RPL15是否维持正常核仁结构。
使用siRNA敲降RPL15，免疫荧光检测nucleolin、fibrillarin和UBF染色面积及强度变化，并计算核仁面积与核面积比值。
RPL15敲降对pre-核糖体亚基形成的影响
验证RPL15是否参与pre-60S核糖体亚基的生物发生。
敲降RPL15后制备核提取物，通过蔗糖梯度超速离心分析pre-核糖体亚基分布。
结肠癌中RPL15表达分析
检测RPL15在结肠癌组织和细胞系中的表达水平及其临床相关性。
通过ONCOMINE数据库分析、免疫印迹、免疫组化和实时PCR检测RPL15在结肠癌细胞系和组织中的表达，并分析其与临床病理特征的相关性。
RPL15缺失对细胞增殖和存活的影响
验证RPL15缺失对结肠癌细胞和正常上皮细胞增殖及凋亡的影响。
在HCT116和RPE1细胞中敲降RPL15，进行MTT、BrdU掺入、流式细胞周期、Annexin V/PI染色和免疫印迹检测相关蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| DMEM:F-12（1:1）培养基 | HyClone | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Life Technologies Inc | -- |
| RNAiMAX转染试剂 | Life Technologies Inc | -- | |
| RPL15 siRNA | Genepharma | -- | |
| 抗体 | α-UBF抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13125 |
| α-p53抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-126 | |
| α-p21抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-397 | |
| α-nucleolin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8031 | |
| α-fibrillarin抗体 | Abcam | ab4566 | |
| α-BrdU抗体 | Cell Signaling Technology | 5292 | |
| α-RPS6抗体 | Cell Signaling Technology | 2317 | |
| α-RPL11抗体 | Life Technologies Inc | 37-3000 | |
| α-H2AX抗体 | Epitomics | 3522-1 | |
| α-Bip抗体 | signalway antibody | 27033 | |
| α-tubulin抗体 | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| 细胞增殖检测 | MTT试剂 | -- | -- |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 核糖核酸酶A | -- | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-PCR | 逆转录试剂盒 | Promega | -- |
| SYBR Green染料 | TIANGEN BIOTECH | -- | |
| 核提取 | RNA酶抑制剂 | Promega | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系来源（ATCC）、培养条件（培养基、血清浓度、CO2浓度）、转染试剂（Lipofectamine 3000和RNAiMAX）、siRNA序列、转染时间（24小时） 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture, transfection and drug treatment; Plasmids, siRNAs and antibodies |
| RPL15亚细胞定位 | 细胞类型（HeLa）、抗体（α-RPL15及其他）、免疫荧光染色步骤、共定位分析方法（Pearson R值） 阅读提示：Results: Cellular localization of RPL15; Materials and Methods: Immunoblotting and immunofluorescence analyses |
| 核仁结构分析 | siRNA转染浓度（未明确说明）、处理时间（48小时）、免疫荧光标记（nucleolin、fibrillarin、UBF）、图像分析参数（面积、IOD/Area）、统计（20个细胞，5次独立实验） 阅读提示：Results: RPL15 is required for maintaining normal nucleolar structure; Figure 2 legends |
| pre-核糖体亚基分析 | 蔗糖梯度离心条件（10%-40%蔗糖梯度）、离心转速和时间（36,000 rpm 3小时）、核提取步骤 阅读提示：Materials and Methods: Preribosome preparation; Results: RPL15 is required for pre-60S ribosomal subunit biogenesis; Figure 3 legend |
| RPL15表达检测 | 细胞系（LoVo, SW480, SW620, HCT116, RPE1）、组织样本（25对）、免疫组化评分标准、实时PCR引物序列、统计学方法（卡方检验、t检验） 阅读提示：Results: RPL15 is overexpressed in colon cancer; Materials and Methods: Tissue samples, RNA isolation and Real-time RT-PCR; Table 1 |
| 增殖与凋亡检测 | 细胞系（HCT116, RPE1）、siRNA转染、MTT检测时间点、BrdU浓度和标记时间（10mM，1小时）、Annexin V/PI染色、caspase 3检测 阅读提示：Materials and Methods: Cell proliferation (MTT) assay, cell cycle analysis and BrdU incorporation assay; Results: RPL15 dependent ribosome stress induces apoptosis in colon cancer cells, but cell cycle arrest in non-transformed epithelial cells; Figure 5 legends |