RNAi筛选鉴定STK25
鉴定调控LATS活性和YAP磷酸化的上游激酶。
在IMR90成纤维细胞中进行定向RNAi筛选，敲低Sterile20激酶超家族成员，用DCB处理激活Hippo信号，通过免疫印迹检测YAP S127磷酸化水平。
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鉴定蛋白激酶STK25为LATS信号的上游激活因子
Identification of the kinase STK25 as an upstream activator of LATS signaling.
实验完整度
高包含RNAi/CRISPR筛选、体外激酶实验、细胞功能验证、小鼠体内模型及TCGA患者数据分析等多层级验证。
主要模型
HEK293A细胞 hTERT-RPE-1细胞 IMR90成纤维细胞 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） STK25基因敲除小鼠
重点核对
STK25敲低或敲除后YAP S127磷酸化水平显著降低（通过免疫印迹检测） 体外激酶实验证实STK25直接磷酸化LATS激活环（使用纯化的HA-LATS2和FLAG-STK25） STK25缺失导致YAP/TAZ靶基因表达上调（通过qPCR和GSEA分析） STK25敲除小鼠表现肝肿大和YAP靶基因表达增加（6-12月龄，肝重/体重比） TCGA数据分析显示STK25在多种癌症中局灶性缺失（如肉瘤中纯合缺失约9%）
摘要
Hippo通路通过负调控致癌转录共激活因子YAP和TAZ来维持组织稳态。尽管Hippo通路的功能性失活在肿瘤中很常见，但核心通路成分的突变却很少见。因此，理解肿瘤细胞如何失活Hippo信号仍然是一个关键未解的问题。在这里，我们确定了激酶STK25作为Hippo信号的一个激活因子。我们证明STK25的缺失促进YAP/TAZ激活和增强的细胞增殖，即使在正常情况下抑制生长的条件下，无论在体外还是体内。值得注意的是，STK25通过促进LATS激活环磷酸化来激活LATS，而不依赖于疏水基序的先前的磷酸化事件，这代表了一种不同于其他LATS激酶激活因子的Hippo激活形式。STK25在多种人类癌症中显著局灶性缺失，表明STK25的缺失可能是肿瘤细胞功能性损害Hippo肿瘤抑制通路的常见机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何识别调控LATS激酶活性的上游激酶，并理解肿瘤细胞失活Hippo通路的机制？
- 核心机制
- STK25通过直接磷酸化LATS的激活环（而非疏水基序）激活LATS，从而促进YAP/TAZ磷酸化失活，该机制独立于MST1/2和MAP4K家族。
- 主要证据
- RNAi筛选鉴定STK25为LATS上游激酶；体外激酶实验证实STK25磷酸化LATS激活环；细胞模型显示STK25缺失导致YAP/TAZ激活和增殖；小鼠模型证实STK25缺失导致肝肿大和YAP活性增加。
- 研究意义
- STK25缺失可能是人类癌症功能性失活Hippo通路的常见机制，STK25可能是一个假定的肿瘤抑制基因。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证STK25功能
确认STK25敲低/敲除对YAP/TAZ磷酸化和激活的影响，排除脱靶效应。
在HEK293A、hTERT-RPE-1等细胞中通过siRNA和CRISPR-Cas9敲除STK25，检测YAP/TAZ磷酸化、核定位及靶基因表达。
体外激酶实验和机制研究
确定STK25是否直接磷酸化LATS并阐明具体机制。
通过免疫沉淀纯化HA-LATS2和FLAG-STK25，进行体外激酶实验，检测LATS疏水基序和激活环的磷酸化情况。使用LATS激酶死突变、STK25激酶死突变、MST1/MAP4K1阳性对照，并在MM8KO、LATS dKO、LS tKO细胞中重复。
细胞生理条件验证
验证STK25在生理相关条件下（如接触抑制、细胞脱落）对LATS-YAP信号的影响。
在接触抑制、悬浮培养、细胞分裂失败等条件下，检测YAP磷酸化和细胞增殖变化。
体内验证
在STK25敲除小鼠中评估Hippo信号激活状态及表型。
分析了STK25+/+和STK25-/-小鼠的肝脏，测量肝重/体重比，通过qPCR和免疫印迹检测YAP靶基因和信号通路蛋白，进行免疫组化检测YAP和PCNA。
人类癌症数据分析
评估STK25在人类癌症中的缺失频率及对患者生存的影响。
使用TCGA数据库通过Tumorscape、cBioPortal和Xena浏览器分析STK25局灶缺失和临床预后。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | ThermoFisher | -- | |
| 青霉素-链霉素 | ThermoFisher | -- | |
| Plasmocin | InvivoGen | -- | |
| 药物处理 | 二氢细胞松弛素B | Sigma-Aldrich | -- |
| 拉特伦库林A | Tocris Bioscience | -- | |
| 转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | ThermoFisher Invitrogen | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | ThermoFisher Invitrogen | -- | |
| 蛋白分析 | PVDF膜 | Bio-Rad | -- |
| ECL Prime化学发光底物 | GE Amersham | -- | |
| Clarity ECL印迹底物 | Bio-Rad | -- | |
| ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫沉淀 | Protein G磁珠 | New England Biolabs | -- |
| Protein A磁珠 | New England Biolabs | -- | |
| RNA提取 | RNeasy RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| RT-qPCR | Superscript III逆转录试剂盒 | Invitrogen | -- |
| SYBR Green荧光染料 | -- | -- | |
| 微阵列分析 | Affymetrix HG-U133_Plus_2基因芯片 | Affymetrix | -- |
| 免疫荧光 | Hoechst染液 | -- | -- |
| 罗丹明标记的鬼笔环肽 | Molecular Probes | -- | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488试剂盒 | ThermoFisher | C10337 | |
| 免疫组化 | 柠檬酸抗原修复液 | Vector Labs | -- |
| SignalStain Boost IHC检测试剂 | Cell Signaling Technology | -- | |
| SignalStain DAB底物试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂 | ThermoFisher Invitrogen | -- | |
| 活细胞成像 | Nikon TE2000-E2倒置显微镜 | Nikon | -- |
| 细胞培养 | 聚凝胺 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| 杀稻瘟菌素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 嘌呤霉素 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 多聚-D-赖氨酸 | Millipore | -- | |
| 蛋白分析 | Phos-tag凝胶 | Wako Chemicals | -- |
| 荧光素酶报告基因实验 | FuGENE HD转染试剂 | Promega | -- |
| Pierce萤火虫荧光素酶发光试剂盒 | Pierce | -- | |
| Pierce海肾荧光素酶发光试剂盒 | Pierce | -- | |
| 抗体 | 抗LATS1抗体 | Cell Signaling Technology | 3477 |
| 抗LATS2抗体 | Cell Signaling Technology | 5888 | |
| 抗YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 14074 | |
| 抗磷酸化YAP S127抗体 | Cell Signaling Technology | 13008 | |
| 抗STK25抗体 | Abcam | ab157188 | |
| 抗MST1抗体 | Cell Signaling Technology | 3682 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗磷酸化LATS T1079抗体 | Cell Signaling Technology | 8654 | |
| 抗磷酸化LATS S909抗体 | Cell Signaling Technology | 9157 | |
| 抗PCNA抗体 | Cell Signaling Technology | 13110 | |
| 抗TAZ抗体 | BD Biosciences | 560235 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma | P2983 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Millipore | CP06-100UG | |
| 抗HA抗体 | Abcam | ab18181 | |
| 抗Myc抗体 | ThermoFisher | MA1-33272 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| STK25敲低/敲除 | 细胞系（HEK293A, IMR90, RPE-1, MEFs）来源、siRNA序列（8种，包括3种靶向3'UTR）、siRNA浓度（50 nM）、CRISPR sgRNA序列（2种）、转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX/3000）、转染后时间（48-72小时） 阅读提示：Methods: Cell culture, Plasmids and transfections; Supplementary Table 4 |
| Hippo信号激活处理 | DCB浓度（10 µM）和处理时间（1小时）、Latrunculin A浓度（1 µg/mL）和处理时间（1小时）、细胞汇合度（亚汇合）、悬浮培养时间 阅读提示：Methods: Cell culture-dependent Hippo signaling analysis |
| 体外激酶实验 | 细胞系（HEK293A, MM8KO, LATS dKO, LS tKO）、免疫沉淀抗体（FLAG, HA）、ATP浓度（100或500 µM）、反应时间（30分钟）、温度（30°C）、LATS2和STK25的WT/KD突变构建 阅读提示：Methods: In vitro kinase assay; Results 相关图注 |
| 小鼠体内实验 | STK25+/+和STK25-/-小鼠、年龄（6-12个月）、肝重/体重比、肝脏免疫印迹、IHC染色（YAP, PCNA）、qPCR靶基因 阅读提示：Methods: Mouse models, Immunohistochemistry; Results 图6图注 |
| 人类癌症数据 | TCGA数据集版本、GISTIC分析、局灶删除阈值、肉瘤患者生存分析（n=215） 阅读提示：Methods: Analysis of TCGA datasets; Results 表1、图7 |