筛选肿瘤相关hnRNP
确定对结直肠癌细胞生长影响最大的hnRNP家族成员
在HCT116细胞中分别敲低20种代表性hnRNP，使用SRB assay检测细胞活力；验证hnRNP A0敲低对多种癌细胞和非癌细胞生长的影响，并过表达hnRNP A0观察效果。
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肿瘤特异性调节异质核核糖核蛋白A0促进结直肠癌细胞过度有丝分裂和生长
A tumor-specific modulation of heterogeneous ribonucleoprotein A0 promotes excessive mitosis and growth in colorectal cancer cells.
实验完整度
高包含体外细胞系筛选、流式细胞术、Western blot、RNA-seq、免疫沉淀、基因编辑、异种移植模型及AOM-DSS小鼠模型等多层级验证。
主要模型
结直肠癌细胞系HCT116 胃癌细胞系MKN45 胰腺癌细胞系SUIT-2和PANC-1 食管癌细胞系OE33 非肿瘤细胞系CoEpiC、HCEC-1CT、Het1A 结直肠癌患者组织样本 异种移植裸鼠模型 AOM-DSS诱导的结直肠癌小鼠模型
重点核对
hnRNP A0敲低显著抑制HCT116、MKN45、SUIT-2、PANC-1、OE33细胞生长，但不影响非肿瘤细胞（n=5） hnRNP A0 siRNA处理HCT116细胞48小时导致G2/M期阻滞（G2/M 68.29%）和染色体错位（62.0%） hnRNP A0磷酸化位点Ser84缺失降低NUDT12、OPN3、RAB3GAP1 mRNA表达并抑制细胞生长 MK-2抑制剂PF-3644022处理HCT116细胞降低hnRNP A0与RAB3GAP1等mRNA结合 AOM-DSS小鼠模型中hnRNP A0或RAB3GAP1敲低减少肿瘤数量
摘要
已显示介导RNA结合的蛋白（RBP）的RNA调节与稳态维持以及癌症进展有关。然而，大多数RBP的肿瘤相关功能以及其抗肿瘤作用的详细机制尚待探索。我们在此报道，磷酸化的异质核核糖核蛋白（hnRNP）A0通过RAS相关蛋白3 GTP酶激活蛋白催化亚基1（RAB3GAP1）-Zeste white 10相互作用子（ZWINT1）级联促进有丝分裂。在结直肠癌细胞中对20种代表性hnRNP（RNA结合蛋白的主要家族）的下调实验显示，hnRNPA0是癌细胞生长的强效调节因子。hnRNPA0的肿瘤促进作用在胃肠癌细胞（包括胰腺癌、食管癌和胃癌细胞）中得到证实，但在非癌细胞中未得到证实。流式细胞术和Western blotting分析显示，hnRNPA0通过维持结直肠癌细胞G2/M期促进来抑制细胞凋亡。对hnRNP A0调控的mRNA的全面分析和免疫染色显示，在结直肠癌细胞中，有丝分裂事件受hnRNPA0-RAB3GAP1 mRNA介导的ZWINT-1稳定化调节，但在非肿瘤细胞中则不然。在癌细胞中，hnRNP A0与mRNA的相互作用随着其磷酸化位点的失活而显著改变，但在非肿瘤细胞中则不然。因此，以RBP异常磷酸化为特征的肿瘤特异性生物学功能被认为是肿瘤治疗的一个有吸引力的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- hnRNP A0在结直肠癌中的肿瘤特异性功能及其作用机制是什么？
- 核心机制
- 磷酸化的hnRNP A0通过稳定RAB3GAP1 mRNA，RAB3GAP1抑制Rab3活性，从而防止ZWINT1蛋白的蛋白酶体降解，维持染色体正确排列，促进有丝分裂和肿瘤生长。
- 主要证据
- 通过hnRNP家族siRNA筛选、RNA免疫沉淀和转录组分析识别hnRNP A0靶标；敲低hnRNP A0或RAB3GAP1导致G2/M期阻滞、染色体错位和凋亡；MG132处理恢复ZWINT1水平；体内异种移植和AOM-DSS模型验证肿瘤促进作用。
- 研究意义
- 磷酸化hnRNP A0是癌症治疗的新靶点，靶向其磷酸化位点（Ser84）可能实现癌症特异性治疗，减少对非肿瘤细胞的副作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证hnRNP A0对细胞周期和凋亡的影响
评估hnRNP A0对结直肠癌细胞有丝分裂和凋亡的调控作用
用hnRNP A0 siRNA处理HCT116细胞48小时，通过流式细胞术分析细胞周期，免疫细胞化学检测染色体排列，Western blot检测cleaved PARP和caspase-3，TUNEL染色检测凋亡。
鉴定hnRNP A0靶标mRNA
识别hnRNP A0直接结合并稳定化的mRNA，确定介导其功能的靶标
通过RNA免疫沉淀（RIP）和RNA-seq分析hnRNP A0结合的mRNA；通过siRNA敲低hnRNP A0后的RNA-seq分析表达变化的mRNA；取交集筛选候选靶标；用siRNA敲低候选靶标验证对细胞活力的影响。
验证磷酸化hnRNP A0对靶标mRNA稳定化的特异性
确认hnRNP A0的磷酸化（Ser84）对其结合和稳定靶标mRNA的必要性
比较非肿瘤细胞CoEpiC中hnRNP A0的靶标；检测癌细胞和非癌细胞中hnRNP A0总蛋白和磷酸化水平；用MK-2抑制剂PF-3644022处理癌细胞，检测靶标mRNA表达；构建Ser84敲除的HCT116细胞（CRISPR-Cas9）检测靶标mRNA表达和细胞生长；在hnRNP A0敲除细胞中过表达hnRNP A0恢复靶标表达；异种移植模型验证PF-3644022的效果。
阐明hnRNP A0-RAB3GAP1-ZWINT1通路
验证hnRNP A0通过RAB3GAP1调控ZWINT1蛋白稳定性和染色体排列的机制
检测RAB3GAP1和OPN3 siRNA对染色体排列的影响；Western blot检测securin和cyclin B1表达；用MG132处理检查ZWINT1降解；IP检测ZWINT1与活性Rab3共定位；构建AOM-DSS模型评估hnRNP A0和RAB3GAP1敲低对肿瘤形成的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5A培养基 | ATCC | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 结肠上皮细胞培养基 | ScienCell | -- | |
| 支气管上皮细胞生长基础培养基 | Lonza | -- | |
| ColoUp培养基 | Biochrom | FG0615 | |
| GlutaMAX™-1 | Gibco | 35050-038 | |
| 宇宙小牛血清 | Hyclone | SH30087 | |
| 表皮生长因子 | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 胰岛素 | Sigma Aldrich | I9278 | |
| 脱铁转铁蛋白 | Sigma Aldrich | T2036 | |
| 氢化可的松 | Sigma Aldrich | H0396 | |
| 蛋白质提取 | 哺乳动物细胞提取试剂盒 | BioVision | -- |
| Western blotting | 硝酸纤维素膜 | -- | -- |
| SuperBlock T-20封闭液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 裂解型caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 裂解型PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 5625 | |
| hnRNP A0抗体 | Novus Biologicals | NBP2-22293 | |
| 磷酸化hnRNP A0抗体 | Signalway Antibody | 12686 | |
| ZWINT1抗体 | Bethyl Laboratories | A300-781A | |
| RAB3GAP1抗体 | Proteintech Group | 21663-1-AP | |
| Securin抗体 | Abcam | ab79546 | |
| Cyclin B1抗体 | Abcam | ab32053 | |
| OPN3抗体 | Abcam | ab75285 | |
| NUDT12抗体 | Proteintech Group | 17487-1-AP | |
| 辣根过氧化物酶标记的二抗 | R&D Systems | -- | |
| SuperSignal West Pico增强化学发光系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 肌动蛋白抗体 | BD Transduction Laboratories | -- | |
| RNA免疫沉淀 | NP-40细胞裂解液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA酶抑制剂 | Promega | -- | |
| 完全蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| Dynabeads免疫沉淀试剂盒 | VERITAS | -- | |
| mirVana RNA分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 实时定量PCR | TaqMan基因表达检测 | -- | -- |
| siRNA转染 | siRNA文库 | Bioneer | -- |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 过表达 | pCI Neo 3×FLAG载体 | -- | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SRB assay | 磺基罗丹明B | -- | -- |
| TUNEL染色 | 细胞凋亡原位检测试剂盒（TMR红色） | Roche Diagnostic | -- |
| 免疫细胞化学 | Hoechst 33342染料 | Invitrogen-Molecular Probes | -- |
| α-微管蛋白抗体 | Novus Biologicals | -- | |
| 活性Rab3抗体 | NewEast Bioscience | -- | |
| ZWINT1抗体 | Bethyl Laboratories | -- | |
| Alexa 594或488标记的二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 转录组分析 | Ion Total RNA-Seq试剂盒v2 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Ion OneTouch系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Ion OneTouch 200模板试剂盒v3 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Ion OneTouch ES系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Ion PI芯片 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Ion Proton半导体测序仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 实时定量PCR | RNeasy小提试剂盒 | Qiagen | -- |
| 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| 流式细胞术 | RNA酶 | Wako Pure Chemicals | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| BD FACSCalibur流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- | |
| 基因编辑 | pX459载体 | Addgene | -- |
| Neon转染系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Applied Biosystems 3500基因分析仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 异种移植 | GENOMONE-Si转染试剂盒 | Ishihara Sangyo | -- |
| AOM-DSS模型 | 氧化偶氮甲烷 | Wako Pure Chemicals | -- |
| 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | -- | |
| 分子对接 | MOE软件 | MOLSIS | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 各细胞系的培养基和添加物，如HCT116用McCoy's 5A，MKN45用RPMI-1640，SUIT-2用DMEM，添加10% FBS等 阅读提示：Materials and methods, Cell culture |
| hnRNP A0敲低 | siRNA序列（hnRNP A0 #1和#2）及转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX） 阅读提示：Materials and methods, siRNA and transfection |
| 细胞周期分析 | 处理时间48小时，流式细胞术检测G1/S/G2/M期比例 阅读提示：Results, Figure 2a；Materials and methods, Flow cytometry |
| RNA免疫沉淀和RNA-seq | 抗体（anti-hnRNP A0），免疫沉淀试剂盒，RNA提取和测序平台 阅读提示：Materials and methods, RNA-immunoprecipitation, Transcriptome analyses |
| 基因编辑（Ser84删除） | CRISPR-Cas9载体（pX459），设计的sgRNA序列，电穿孔系统 阅读提示：Materials and methods, Gene editing of HNRNP A0 |
| 异种移植模型 | HCT116细胞数量（2×10^6），小鼠品系（BALB/c nude），siRNA注射频率（每日） 阅读提示：Materials and methods, Xenografts |
| AOM-DSS模型 | AOM剂量（10 mg/kg），DSS浓度（1%），处理周期，siRNA给药频率（每2天） 阅读提示：Materials and methods, AOM–DSS carcinogenesis mice model |